Количественный авторадиографический метод для определения региональных показателей синтеза церебрального белка в Vivo

Синтез белка является важным биологическим процессом, необходимым длядолгосрочных адаптивных изменений в нервной системе 1. Ингибирование синтеза белка блокирует длительное хранение памятикак у беспозвоночных, так и у позвоночных 2. Синтез белка необходим для поддержания поздних фаз некоторых форм долгосрочного потенции (ЛТП) и длительной депрессии (LTD)³, выживаемости нейронов при разработке^4,а также для общего поддержания нейрона и его синаптические соединения⁵. Измерение темпов синтеза белка мозга может быть важным инструментом для изучения адаптивных изменений, а также нейроразвития расстройств и расстройств, связанных с обучением и памятью.

Мы разработали метод количественной оценки темпов синтеза церебрального белка in vivo в бодрствующих животных, который предлагает присущие преимущества по сравнению с другими методами, которые оценивают скорость в ex vivo или in vitro препаратов ткани мозга⁶. В первую очередь применимость к измерениям в нетронутом мозге у бодрствуем животного. Это ключевое соображение, поскольку оно позволяет измерения с синаптической структуры и функции на месте и без опасений по поводу посмертного эффектов. Кроме того, количественный авторадиографический подход, который мы используем, достигает высокой степени пространственной локализации. В то время как энергия ¹⁴C такова, что мы не можем локализовать трассировщик на субклеточном или клеточном уровне, мы можем измерить скорость в слоях клеток и небольших областях мозга, таких как гипоталамические ядра, примерно с разрешением 25 мкм⁷.

Одна из задач in vivo измерений с радиотизмерителями заключается в том, чтобы гарантировать, что радиомаркировка измеряется в продукте реакции интереса, а не неотреагированы помечены предшественником или других посторонних помечены метаболических продуктов⁶. Мы выбрали L-1-¹⁴C-leucine в качестве аминокислоты трассировщика, потому что она либо включена в белок, либо быстро метаболизируется до ¹⁴CO_2, которая разбавляется в большом пуле немаркированного CO₂ в мозге в результате высокой скорости энергетический метаболизм⁸. Кроме того, любой ¹⁴C не включены в белок существует в первую очередь как свободный –¹⁴C-leucine, который в течение 60 минут экспериментального периода, почти полностью очищены от ткани⁶. Белки затем фиксируются в ткани с формалином, а затем промыть водой, чтобы удалить любые свободные¹⁴C-leucine до авторрадиографии.

Другим важным соображением является вопрос о разбавлении специфической активности аминокислотного пула прекурсоров немаркированными аминокислотами, полученными из протеолиза тканей. Мы показали, что у взрослых крыс и мышей, около 40% из резерва лейцина бассейн для синтеза белка в мозге происходит от аминокислот, полученных из белка распада⁶. Это должно быть включено в расчет региональных показателей синтеза церебрального белка (rCPS) и должно быть подтверждено в исследованиях, в которых эта взаимосвязь может измениться. Теоретическая основа и предположения метода были подробно представлены в другом месте⁶. В настоящем документе мы сосредоточиваемся на процедурных вопросах применения этой методологии.

Этот метод был использован для определения rCPSу сусликов 9, овец¹⁰, ресус обезьян¹¹, крыс^{12,13,14,15,16 , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21}, мышь модель туберозного склероза комплекса²², мышь модель хрупкого синдрома X^23,24,25,26, хрупкие X перестановки мышей²⁷, и мышиная модель фенилкетонурии²⁸. В этой рукописи мы представляем процедуры измерения rCPS с помощью метода in vivo авторадиографического L-1-¹⁴C-leucine. Мы представляем rCPS в областях мозга пряткать мышь управления. Мы также демонстрируем, что in vivo введение анисомицина, ингибитора перевода, отменяет синтез белка в головном мозге.