Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo
Summary
La synthèse des protéines est un processus biologique essentiel pour les cellules. Dans le cerveau, il est nécessaire pour les changements adaptatifs. La mesure des taux de synthèse des protéines dans le cerveau intact nécessite des considérations méthodologiques soignelées. Ici nous présentons la méthode autoradiographique quantitative de L-[1-14C]-leucine pour déterminer des taux régionaux de synthèse cérébrale de protéine in vivo.
Abstract
La synthèse des protéines est nécessaire pour le développement et le maintien de la fonction neuronale et est impliquée dans les changements adaptatifs dans le système nerveux. En outre, on pense que la dysrégulation de la synthèse des protéines dans le système nerveux peut être un phénotype de base dans certains troubles du développement. La mesure précise des taux de synthèse des protéines cérébrales dans les modèles animaux est importante pour comprendre ces troubles. La méthode que nous avons développée a été conçue pour être appliquée à l’étude des animaux éveillés et se comportant. Il s’agit d’une méthode autoradiographique quantitative, de sorte qu’il peut produire des taux dans toutes les régions du cerveau simultanément. La méthode est basée sur l’utilisation d’un acide aminé traceur, L-[1-14C]-leucine, et un modèle cinétique du comportement de L-leucine dans le cerveau. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme traceur parce qu’elle ne conduit pas à des produits métaboliques étiquetés par des produits non-terrestres. Il est soit incorporé dans les protéines ou rapidement métabolisé pour produire 14CO2 qui est dilué dans un grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau. La méthode et le modèle permettent également la contribution de la leucine non étiquetée dérivée de la protéolyse tissulaire au pool de précurseurs tissulaires pour la synthèse des protéines. La méthode a la résolution spatiale pour déterminer les taux de synthèse des protéines dans les couches cellulaires et neuropil, ainsi que les noyaux hypothalamiques et crâniens nerf. Pour obtenir des données quantitatives fiables et reproductibles, il est important d’adhérer aux détails de la procédure. Ici, nous présentons les procédures détaillées de la méthode quantitative autoradiographique L-[1-14C]-leucine pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines in vivo.
Introduction
La synthèse des protéines est un processus biologique important requis pour un changement adaptatif à long terme dans le système nerveux1. L’inhibition de la synthèse des protéines bloque le stockage de la mémoire à long terme chez les invertébrés et les vertébrés2. La synthèse des protéines est essentielle pour le maintien des phases tardives de certaines formes de potentialisation à long terme (LTP) et de dépression à long terme (LTD)3, survie neuronale pendant le développement4, et pour le maintien général du neurone et de ses connexions synaptiques5. La mesure des taux de synthèse des protéines cérébrales peut être un outil important pour étudier les changements adaptatifs ainsi que les troubles neurodéveloppementaux et les troubles liés à l’apprentissage et à la mémoire.
Nous avons développé une méthode pour quantifier les taux de synthèse des protéines cérébrales in vivo chez un animal éveillé qui offre des avantages inhérents à d’autres techniques qui estiment les taux de préparations ex vivo ou in vitro des tissus cérébraux6. Le premier est l’applicabilité aux mesures dans le cerveau intact dans un animal éveillé. Il s’agit d’une considération clé, car il permet des mesures avec la structure synaptique et la fonction en place et sans préoccupations au sujet des effets post mortem. En outre, l’approche autoradiographique quantitative que nous employons atteint un degré élevé de localisation spatiale. Alors que l’énergie de 14C est telle que nous ne pouvons pas localiser le traceur au niveau subcellulaire ou cellulaire, nous pouvons mesurer les taux dans les couches cellulaires et les petites régions du cerveau telles que les noyaux hypothalamiques, avec environ une résolution de 25 m7.
Un défi des mesures in vivo avec des radiotracers est de s’assurer que l’étiquette radio mesurée est dans le produit de la réaction d’intérêt plutôt que le précurseur étiqueté non réagi ou d’autres produits métaboliques étiquetés non associés6. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme acide aminé traceur parce qu’il est soit incorporé dans la protéine ou rapidement métabolisé à 14CO2, qui est dilué dans le grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau résultant du taux élevé de métabolisme énergétique8. En outre, tout 14C non incorporé dans la protéine existe principalement comme libre [14C]-leucine, qui au cours de la période expérimentale de 60 min, est presque entièrement effacé du tissu6. Les protéines sont ensuite fixées aux tissus avec formaline et ensuite rincées avec de l’eau pour enlever toute leucine libre[14C]-leucine avant l’autoradiographie.
Une autre considération importante est la question de la dilution de l’activité spécifique du pool d’acides aminés précurseurs par des acides aminés non étiquetés dérivés de la protéolyse tissulaire. Nous avons montré que chez le rat et la souris adultes, environ 40% du bassin précurseur de leucine pour la synthèse des protéines dans le cerveau provient d’acides aminés dérivés de la dégradation des protéines6. Ceci doit être inclus dans le calcul des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (RCPS) et doit être confirmé dans les études dans lesquelles cette relation peut changer. La base théorique et les hypothèses de la méthode ont été présentées en détail ailleurs6. Dans le présent document, nous nous concentrons sur les questions de procédure de l’application de cette méthodologie.
Cette méthode a été utilisée pour la détermination de rCPS chez les écureuils terrestres9, moutons10, singes rhésus11, rats12,13,14,15,16 , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21, un modèle de souris de tubercule la sclérose complexe22, un modèle de souris du syndrome X fragile23,24,25,26, fragileX souris prémutation27, et un modèle de souris de phénylketonuria28. Dans ce manuscrit, nous présentons les procédures de mesure de rCPS avec la méthode autoradiographique in vivo L-[1-14C]-leucine. Nous présentons rCPS dans les régions de cerveau d’une souris de contrôle éveillée. Nous démontrons également que l’administration in vivo de l’anisomycine, un inhibiteur de la traduction, abolit la synthèse des protéines dans le cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons une méthode quantitative pour déterminer les taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (rCPS) in vivo chez les animaux expérimentaux. Cette méthode présente des avantages considérables par rapport aux méthodes existantes : 1. Les mesures sont effectuées chez l’animal qui se comporte éveillé, de sorte qu’elles reflètent les processus continus dans le cerveau qui fonctionne. 2. Les mesures sont faites au moyen de l’autoradiographie quantitative offrant la capacité de déterminer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Zengyan Xia pour le génotypage des souris, Tom Burlin pour le traitement des acides aminés et des films, et Mei Qin pour avoir effectué certaines des expériences rCPS. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NIMH, ZIA MH00889. RMS a également reçu un programme de bourses postdoctorales Autism Speaks 8679 et une bourse postdoctorale FRAXA.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
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