Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Die Proteinsynthese ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für eine langfristige adaptive Veränderung des Nervensystems erforderlich ist¹. Hemmende Proteinsynthese blockiert die Langzeitspeicherspeicherung bei Wirbellosen und Wirbeltieren². Proteinsynthese ist wichtig für die Aufrechterhaltung der späten Phasen einiger Formen der Langzeitpotenzierung (LTP) und Langzeitdepression (LTD)³, neuronale Überleben während der Entwicklung⁴, und für die allgemeine Wartung des Neurons und seiner synaptische Verbindungen⁵. Die Messung der Raten der Proteinsynthese des Gehirns kann ein wichtiges Werkzeug sein, um adaptive Veränderungen sowie neuroentwicklungsbedingte Störungen und Störungen im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis zu studieren.

Wir haben eine Methode entwickelt, um die Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo in einem wachen Tier zu quantifizieren, das inhärente Vorteile gegenüber anderen Techniken bietet, die Raten in ex vivo oder In-vitro-Präparaten von Hirngewebe schätzen⁶. Vor allem die Anwendbarkeit auf Messungen im intakten Gehirn eines wachen Tieres. Dies ist eine wichtige Überlegung, weil es Messungen mit synaptischen Struktur und Funktion an Ort und Stelle und ohne Bedenken über post-mortem Effekte ermöglicht. Darüber hinaus erreicht der von uns einsetzende quantitative autoradiografische Ansatz einen hohen Grad an räumlicher Lokalisierung. Während die Energie von ¹⁴C so ist, dass wir den Tracer nicht auf subzellulärer oder zellulärer Ebene lokalisieren können, könnenwir Raten in Zellschichten und kleinen Hirnregionen wie hypothalamischen Kernen mit einer Auflösung von etwa 25 m 7 messen.

Eine Herausforderung bei In-vivo-Messungen mit Radiotracern besteht darin, sicherzustellen, dass das gemessene Radiolabel im Produkt der Reaktion von Interesse liegt und nicht unreagierte gekennzeichnete Vorläufer oder andere fremdmarkierte Stoffwechselprodukte⁶. Wir haben L-[1-¹⁴C]-Leucin als Tracer-Aminosäure gewählt, weil es entweder in Protein eingliedert oder schnell zu ¹⁴CO2 metabolisiert wird, das in dem großen Pool von unbeschriftetem CO2 im Gehirn verdünnt wird, das aus der hohen Rate von Energiestoffwechsel⁸. Darüber hinaus existiert jedes ¹⁴C, das nicht in Proteine eingearbeitet ist, in erster Linie als freies [¹⁴C]-Leucin, das während der 60-min-Versuchsphase fast vollständig aus dem Gewebe⁶. Proteine werden dann mit Formalin am Gewebe fixiert und anschließend mit Wasser abspült, um freies^[14C]-Leucin vor der Autoradiographie zu entfernen.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Frage der Verdünnung der spezifischen Aktivität des Vorläufer-Aminosäurepools durch unbeschriftete Aminosäuren aus Gewebeproteolyse. Wir haben gezeigt, dass bei erwachsenen Ratten und Mäusen etwa 40% des Vorläufer-Leucin-Pools für die Proteinsynthese im Gehirn aus Aminosäuren stammt, die aus dem Proteinabbau⁶gewonnen wurden. Dies muss in die Berechnung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese (rCPS) einbezogen werden und muss in Studien bestätigt werden, in denen sich diese Beziehung ändern kann. Die theoretische Grundlage und die Annahmen der Methode wurden an anderer Stelle ausführlich dargestellt⁶. In diesem Papier konzentrieren wir uns auf die Verfahrensfragen bei der Anwendung dieser Methode.

Diese Methode wurde für die Bestimmung von rCPS in Bodenhörnchen⁹, Schafe¹⁰, Rhesusaffen¹¹, Ratten^{12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21}, ein Mausmodell des Tuberöse-Sklerose-Komplexes²², ein Mausmodell des fragilen X-Syndroms^23,24,25,26, fragile X-Prämutationsmäuse²⁷und ein Mausmodell von Phenylketonuria²⁸. In diesem Manuskript stellen wir die Verfahren zur Messung von rCPS mit der in vivo autoradiographischen L-[1-¹⁴C]-Leucin-Methode vor. Wir präsentieren rCPS in Hirnregionen einer wachen Kontrollmaus. Wir zeigen auch, dass die In-vivo-Verabreichung von Anisomycin, einem Inhibitor der Translation, die Proteinsynthese im Gehirn abschafft.