طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو
Summary
تخليق البروتين هو عملية بيولوجية حاسمة للخلايا. في الدماغ، وهو مطلوب للتغيرات التكيفية. قياس معدلات تخليق البروتين في الدماغ سليمة يتطلب اعتبارات منهجية متأنية. هنا نقدم L-[1-14C]-leucine طريقة أوتوراديوغرافية كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي.
Abstract
مطلوب تخليق البروتين لتطوير وصيانة وظيفة الخلايا العصبية وتشارك في التغيرات التكيفية في الجهاز العصبي. وعلاوة على ذلك، يعتقد أن خلل تنظيم تخليق البروتين في الجهاز العصبي قد يكون النمط الظاهري الأساسي في بعض اضطرابات النمو. قياس دقيق لمعدلات تخليق البروتين الدماغي في النماذج الحيوانية مهم لفهم هذه الاضطرابات. تم تصميم الطريقة التي قمنا بتطويرها ليتم تطبيقها على دراسة الحيوانات مستيقظا، تتصرف. بل هو طريقة أوتوراديوغرافيا كمية، لذلك يمكن أن تسفر عن معدلات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد. ويستند الأسلوب على استخدام الأحماض الأمينية التتبع، L-[1-14C] -ليوسين، ونموذج حركي لسلوك L-ليوسين في الدماغ. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كما التتبع لأنه لا يؤدي إلى المنتجات الأيضية خارج المسمى. يتم دمجها إما في البروتين أو استقلاب بسرعة لإنتاج 14CO2 الذي يتم تخفيفه في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ. كما تسمح الطريقة والنموذج بمساهمة ليوسين غير المسمى المستمد من الانُسِّال الأنسجة يُستمد من الانُسِّما الأنسجة في مجمع السلائف للأنسجة من أجل تخليق البروتين. هذه الطريقة لديها القرار المكاني لتحديد معدلات تخليق البروتين في الخلايا وطبقات neuropil، فضلا عن النوى العصبية تحت المهاد واليورانيوم. وللحصول على بيانات كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ، من المهم التقيد بالتفاصيل الإجرائية. هنا نقدم الإجراءات التفصيلية للطريقة الكمية الأوتوراديوغرافية L-[1-14C]-leucine لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين في الجسم الحي.
Introduction
تخليق البروتين هو عملية بيولوجية هامة مطلوبة للتغيير التكيفي على المدى الطويل في الجهاز العصبي1. تثبيط تخليق البروتين كتل تخزين الذاكرة على المدى الطويل في كل من اللافقاريات والفقاريات2. تخليق البروتين ضروري للحفاظ على المراحل المتأخرة من بعض أشكال التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب على المدى الطويل (LTD)3، بقاء الخلايا العصبية أثناء التنمية4، وللصيانة العامة للخلية العصبية ولها اتصالات متشابك5. قد يكون قياس معدلات تخليق بروتين الدماغ أداة هامة لدراسة التغيرات التكيفية وكذلك اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات المتعلقة بالتعلم والذاكرة.
لقد قمنا بتطوير طريقة لتحديد معدلات تخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي في الحيوان مستيقظا الذي يقدم مزايامتأصلة على التقنيات الأخرى التي تقدر معدلات في الجسم الحي السابق أو في المختبر الاستعدادات من أنسجة الدماغ 6. قبل كل شيء هو التطبيق على القياسات في الدماغ سليمة في الحيوان مستيقظا. هذا هو الاعتبار الرئيسي لأنه يسمح القياسات مع بنية متشابك وظيفة في مكان ودون مخاوف حول آثار ما بعد الوفاة. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الكمّي الذي نستخدمه يحقق درجة عالية من التعريب المكاني. في حين أن الطاقة من 14C هو من هذا القبيل أننا لا يمكن توطين التتبع على المستوى دون الخلوي أو الخلوي، يمكننا قياس معدلات في طبقات الخلايا ومناطق الدماغ الصغيرة مثل النوى تحت المهاد، مع ما يقرب من 25 ميكرومتر القرار7.
أحد التحديات في قياسات الجسم الحي مع radiotracers هو التأكد من أن تسمية الراديو تقاس هو في نتاج رد فعل الفائدة بدلا من غير رد فعل المسمى السلائف أو غيرها من المنتجات الأيضية الخارجية المسمى6. اخترنا L-[1-14C]-ليوسين كحمض أميني التتبع لأنه إما دمجها في البروتين أو استقلاب بسرعة إلى 14CO2، والتي يتم تخفيفها في مجموعة كبيرة من CO2 غير المسمى في الدماغ الناجمة عن ارتفاع معدل استقلاب الطاقة8. وعلاوة على ذلك، أي 14C غير المدرجة في البروتين موجود في المقام الأول كما الحرة [14C] -ليوسين، والتي على مدى 60 دقيقة الفترة التجريبية، يتم تطهيرها تماما تقريبا من الأنسجة6. ثم يتم تثبيت البروتينات على الأنسجة مع الفورمالين وشطفها في وقت لاحق مع الماء لإزالة أي حر [14C] -ليوسين قبل التصوير الشعاعي.
وثمة اعتبار هام آخر هو مسألة تخفيف النشاط المحدد لتجمع الأحماض الأمينية السليفة بواسطة الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدة من البروتيوليسيا الأنسجة. لقد أظهرنا أنه في الفئران والفئران الكبار، حوالي 40٪ من تجمع ليوسين السلائف لتخليق البروتين في الدماغ يأتي من الأحماض الأمينية المستمدة من انهيار البروتين6. يجب أن يتم تضمين ذلك في حساب المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) ويجب تأكيده في الدراسات التي قد تتغير فيها هذه العلاقة. وقد عُرض الأساس النظري وافتراضات الطريقة بالتفصيل في أماكن أخرى6. وفي هذه الورقة، نركز على المسائل الإجرائية لتطبيق هذه المنهجية.
وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد rCPS في السناجب الأرض9، الأغنام10، الفئران الركيس11، الفئران12،13،14،15،16 , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21، نموذج الماوس من التصلب الدرني مجمع22، نموذج الماوس من متلازمة X الهشة23،24،25،26، الهشة X الفئران premutation27، و نموذج الماوس من فينيلكيتونيوريا28. في هذه المخطوطة، نقدم إجراءات قياس rCPS مع طريقة L-[1-14C]-leucine في الجسم الحي. نحن نقدم rCPS في مناطق الدماغ من فأر التحكم مستيقظا. كما نثبت أنه في إدارة الجسم الحي للإيزوميسين، وهو مثبط للترجمة، يلغي تخليق البروتين في الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم طريقة كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) في الجسم الحي في الحيوانات التجريبية. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة على الأساليب القائمة: 1. يتم إجراء القياسات في الحيوان مستيقظا يتصرف، بحيث تعكس العمليات الجارية في الدماغ يعمل. 2 – وتُبذل القياسات عن طريق التصوير الشع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعترفوا بـ Zengyan Xia لكتابة الفئران، وتوم بيرلين لمعالجة الأحماض الأمينية والأفلام، وMei Qin لأداء بعض التجارب rCPS. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من NIMH، ZIA MH00889. كما تم دعم RMS من قبل التوحد يتحدث زمالة ما بعد الدكتوراه 8679 وزمالة FRAXA ما بعد الدكتوراه.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
