Мышь сингенных B-клеточной лимфомы модель для предварительно клинической оценки CD19 автомобилей Т-клеток

Все эксперименты на животных были проведены под эгидой Закон 1986 года о животных (научные процедуры) и под Великобритании Координационного комитета для исследований рака руководящих принципов. Все исследования на животных были проведены в институте CRUK-Манчестер и одобрены местных животных и этики обзор тела (CRUK-ми AWERB). 1. Подготовка Maxiprep pMP71 ретровирусной построить плазмиды и pCL эко ретровируса упаковки плазмид18.Примечание: pMP71 кодирует mCherry и автомобиль, разделенных FMDV2A последовательности. Это взаимозаменяемы с другими ретровирусной конструкции. pCL эко кодирует кляп, ГСМ и ecotropic конверт белков. Подготовка среднего полного Т-клеток (TCM) для культивирования клеток мыши T с помощью RPMI 1640 средних, 10% FCS, 1% 100 x пенициллин стрептомицином глютамин (ПСЖ).Примечание: Решение содержит 100 МЕ/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мм L-глютамин), 50 мкм β-меркаптоэтанол и 25 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES). Культура клетки A20 RPMI 1640, 10% FCS и β-меркаптоэтанол 0.05 мм при 37 ° C, 5% CO2. Культура клетки платины-Е Plat-Е в среде полного Дульбекко модифицированных орла (DMEM) (DMEM с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 2 мм L-глютамином, 1 мкг/мл puromycin и 10 мкг/мл blasticidin) при 37 ° C, 5% CO2.Примечание: Плат-E клетки являются производными от 293T клеток и выразить кляп, ГСМ и ecotropic конверт ретровирусной белков. Подготовьте трансфекции медиа решения 1 и 2 непосредственно перед transfection. Готовят раствор 1 (рН 7,9) содержат DMEM + 10% FCS + 25 мм HEPES, решение 2 (рН 7,1) содержат DMEM + 25 мм HEPES. Подготовка 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент решения путем разбавления с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) и хранить при температуре от-20 ° C до использования. Стерильными фильтр все средства массовой информации через 0,2 мкм фильтры до использования (за исключением рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент). 2. антиретровирусные трансдукции Т-клеток День 1: Подготовка к трансфекции Семя 7,5 х 106 Platinum-Е (Plat-E) клетки в 15 см2 культуры ткани блюда в 18 мл полного DMEM и инкубировать на ночь при 37 ° C, 5% CO2. День 2: Transfection Plat-E ретровирусной упаковки клеточной линии Подготовьте 20.4 мкг pcl Эко упаковка вектора ДНК, 39,6 мкг плазмида ДНК кодирования ретровирусной конструкции автомобиля и 150 мкл CaCl 1 М2 заключительный объемом 3 мл раствора трансфекции 2 за 15 см2 блюдо transfected. Вортекс для 10 s и отдыха за 5 мин Удаление DMEM СМИ от 15 см2 блюда и заменить 12 мл раствора 1 transfection.Предостережение При изменении средства массовой информации, 15 см2 блюда можно высушить в центре. Это может привести к существенной смерти transfected клеток Plat-E. Работать быстро и извлеките из всего 1-2 плиты одновременно. Добавьте 3 мл трансфекции решение 2, содержащий ДНК и CaCl2 к каждому блюду 15 см2 каплям, равномерно через каждую пластину. Осторожно покачайте пластины с бокового движения для 10 s. инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на ночь. День 3: Подготовка вирус содержащих супернатанта для трансдукции Заменить СМИ transfected клеток пластины-E с 18 мл завершить TCM и вернуться в инкубатор.Предостережение Когда изменение средств массовой информации 15 см2 блюда можно высушить в центре. Это может привести к существенной смерти transfected клеток Plat-E. Работать быстро и извлеките из всего 1-2 плиты одновременно. День 3: Изоляции и в пробирке активация Т-клеток мыши селезеночной Удаление селезенки из 6-8-week-old мышей BALB/c, как описано ранее, Паркинсона и др. 19 и погрузить их в стерильные, ледяной, PBS в 50 мл Конические трубки. Используйте щипчики для передачи селезенки пробки microcentrifuge 1,5 мл и гомогенизации, с помощью пестика с минимальной силой. Использование пипетки 1000 мкл и ~ 800 мкл PBS передать стрейнер клеток поры 100 мкм, проставленный на тюбик 50 мл, содержащие 5 мл PBS для достижения одной ячейки подвеска огневки. Повторите шаг 2.4.2 для дополнительной селезенки. Не превышать 3 селезенки в трубку.Предостережение Splenocytes прошло через фильтр могут образовывать сгустки, если осталось. Вручную, вихревой трубы с перерывами, если обработка нескольких селезенки во избежание слипания клеток. Остальные фрагменты на ячейки фильтра может быть далее пюре с использованием плунжера от 5 мл шприц, с использованием минимальной силы. Топ 20 мл с PBS. Слой 20 мл суспензии клеток нежно на 20 мл градиента плотности СМИ (Таблица материалов) в 50 мл трубки. Центрифуга для результирующей обложил подвеска на 800 x g 20 мин с не на педаль. Урожай клетки на уровне интерфейса, используя стерильные пипетки Пастера и передачи 50 мл трубки. Топ до 50 мл с PBS и центрифуги на 800 x g за 10 мин, чтобы мыть. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки в полной TCM. Подсчитать количество ячеек с помощью Горяева. Культура клетки на плотности тарелок 5 x 106 клеток/мл в полной TCM с 30 нг/мл антитела анти CD3ε (клон 145-2 C 11), 30 нг/мл антитела анти CD28 (клон 37.51), 100 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-2 и 2 нг/мл рекомбинантной мышиных IL-7. Используйте настой соответствующего размера культуры ткани для объема клетки собирают.Примечание: Антиген–представляющие клетки необходимы для активации Т-клеток, CD3 и CD28 антител, если работы с очищенной клетки T он необходим для пальто плит с антителами, или использовать магнитные шарики (Таблица материалов) Инкубируйте splenocytes мыши при 37 ° C, 5% CO2 на ночь. День 3: Подготовка пластин для трансдукции Слой тканевой культуры 6-ну пластины с 2 мл 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент и инкубировать на ночь при 4 ° C. День 4: Трансдукции клеток мыши T Передавать рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент из пластины с покрытием свежие пластины 6-ну тканевой культуры. Инкубируйте эти пластины на ночь при 4 ° C для круглые 2 трансдукции. Добавить 2 мл ТКМ в каждой скважине оригинальных пластин с покрытием фрагмент содержит рекомбинантного человеческого фибронектина и оставить на 30 минут при комнатной температуре блокировать неспецифической привязки. Урожай ретровируса содержащих супернатант из transfected клеток Plat-E 15 см культуры ткани блюда и заменить 18 мл полной TCM.Предостережение Работе быстро, чтобы избежать высыхания Plat-E клеток.Примечание: Успех transfection может быть проверена на данном этапе по микроскопии флуоресцирования, если использование флуоресцентных маркеров ген как mCherry (рис. 1). Фильтр ретровируса содержащих супернатант через 0.45 мкм фильтр для удаления мусора ячейки. Удалить TCM из рекомбинантного человеческого фибронектин покрытием фрагмент 6-ну плит и добавить 2,5 мл отфильтрованных ретровируса содержащих супернатант или для каждой скважины (использование полное TCM для макет трансфекции). Этикетке каждого также добавлением ретровируса или макет СМИ. Центрифуга пластины на 1200 x г за 30 мин при комнатной температуре. Хотя пластин спиннинг, собирать активированные Т-клеток и рассчитывать, с помощью Горяева. Трансдукция осуществляется с 5 х 106 активировано splenocytes в общей сложности 5 мл/хорошо. Пелле требуемое количество splenocytes для МОК/трансдукции в отдельных труб центрифугированием на 500 g x 5 мин. Вновь приостановите splenocytes на плотности тарелок 5 x 106 клеток на 2,5 мл отфильтрованных ретровируса содержащих супернатант из шага 2.6.4 или TCM как отрицательный контроль. Добавьте рекомбинантный человеческий Ил-2 (hIL-2) и мышь рекомбинантного ИЛ-7 (mIL-7) в конечной концентрации 200 МЕ/мл и 4 нг/мл соответственно. Собирать 6-ну пластины из центрифуги на завершения шага 2.6.5 и добавить 2,5 мл/а вновь приостановлено splenocytes в соответствующие скважин, чтобы сделать окончательный объем 5 мл/Ну и конечная концентрация 100 ед/мл Хиль-2 и 2 нг/мл mIL-7. Центрифуга пластины на 1200 g x 90 мин при комнатной температуре. После центрифугирования Инкубируйте пластины при 37 ° C, 5% CO2 на ночь. День 5: Раунд 2 трансдукция Соберите рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент из пластин, как это может быть повторно использован. Повторите шаги 2.6.2 – 2.6.5. Хотя пластин спиннинг, соберите клетки от 1st раунд трансдукция с помощью пипетки Пастера. Промойте каждую лунку с 2 мл PBS, вихрем и собирать любые оставшиеся ячейки в каждой скважине.Примечание: Пипетка вверх и вниз, чтобы вновь приостановить отложившейся клетки. Собирайте каждой группы управления/трансдукции в отдельных труб. Пробирок на 500 x g для 5 минут вновь приостановить ячеек в 2,5 мл на хорошо трансдукция с 200 МЕ/мл Ил-2 и 4 нг/мл IL-7. Повторите шаги 2.6.7 – 2.6.8. Удаление ячеек из центрифуги и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на 4 ч собирают преобразованы клетки как шаги 2.7.2-2.7.3. Подсчет количества ячеек, центрифуги на 500 x g 5 минут и вновь приостановить в полной TCM на плотности 1 х 106 клеток/мл с 100 ед/мл Хиль-2 и 2ng/мл mIL-7. Трансфер в колбе подходящего размера культуры и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2. Добавить свежие средства массовой информации TCM, содержащих 100У/мл Хиль-2 и 2ng/мл mIL-7 каждые 2 дня, поддержание плотность клеток 1 х 106 клеток/мл.Примечание: Собранный splenocytes содержат различные типы клеток. В этих условиях культуры не Т-клетки отмирают в течение 2-3 дней. После ~ 4 дней в культуре клеток, количество клеток T эквивалентно обычно общее количество собранного splenocytes день 0. 3. Измерение эффективности трансдукция На 4 день пост трансдукции Соберите образец transduced или не преобразованы Т-клеток (примерно 3 x 105 клеток). Центрифуга суспензию клеток на 500 x g 5 минут, удалить супернатант, Вымойте гранулированных клетки один раз с PBS и центрифуги снова. Отменить супернатант и добавить 100 мкл PBS, содержащий подходящие Амин реактивной краситель (например, жить/мертвые пятна, 1 100 разрежения) за хорошо. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре в темноте. Мыть дважды с PBS и центрифуги на 500 g x 5 мин удалить супернатант и проинкубируйте с 50 мкл буфера СУИМ, содержащий CD16/CD32 антитела анти мыши для Fc рецептор, блокирование (1 100 разрежения). Проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Сразу добавьте 50 мкл антитело пятная мастер смеси, содержащие анти мыши CD4 BV786 и CD8-BV711 антител (конечная концентрация 1 мкл/скважины в буфере СУИМ). Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C в темноте. Повторите шаг мыть 3.3. Вновь приостановить клеток в 1% PFA буфера и держать в темноте при температуре 4 ° C до анализа подачей cytometry. Анализ клеток с эквивалентной подходит цитометр, используя BV711, BV785 и mCherry флуоресценции в качестве маркеров CD4 и CD8 подмножества и автомобиль выражения, соответственно, память, как показано на (рис. 2). 4. в vitro проверки автомобилей Т-клеток деятельности Семян сингенных целевых CD19+ опухолевых клеток с или без Люцифераза выражение на плотности 1 х 104 клеток в 100 мкл TCM/хорошо в 96-Ну U-нижней плиты культуры ткани. Добавьте 1 х 104 CD19 автомобилей T клетки/колодец в объеме 100 мкл/хорошо для достижения эффекторных целевой (E:T) соотношение 1:1.Примечание: E:T коэффициенты должны устанавливаться для каждого автомобиля и целевой линии клеток. Использование T клетки только и только как негативный контроль опухолевые клетки и Т-клетки под воздействием phorbol миристат ацетат (PMA) (50 нг/мл) и ionomycin (1 мкг/мл) как положительный контроль для интерферона гамма (IFNγ) выпуска. Совместное культуры клеток при 37 ° C, 5% CO2 для 16-24 ч. После совместного культуры центрифуга пластины на 500 g x 5 мин и собирать супернатант для дальнейшего анализа IFNγ и Ил – 12 p 70 ELISA.Примечание: Это может храниться при температуре-80 ° C. Вновь приостановите клеток окатышей в 100 мкл PBS, содержащих Люциферин (конечная концентрация 1,5 мг/мл). Инкубировать пластины для 10 минут при 37 ° C. Затем измерения люминесценции от каждой скважины с подходящей люминометра.Примечание: Время экспозиции должны быть оптимизированы для клеточных линий и плотности. Представитель результаты показаны на рисунке 3a. Ex vivo цитотоксичность автомобилей Т-клеток могут быть изменены Экспресс люциферин Сопредседатель культуры с клеточных линий, выражая цель антигена. Как автомобиль Т-клетки убить клетки-мишени, выпустила люциферин, поэтому снижение luminometry сигнала соотносится с убить клетки. Non преобразованы клетки часто может иметь влияние на жизнеспособность клеток цели, особенно на длительный инкубационный период. Измерьте концентрацию мышиных IFNγ и Ил – 12p 70 в надосадке согласно производителя ELISA протоколы. Представитель результаты отображаются в (рис. 3b и 3 c). Ex-vivo активации автомобилей Т-клеток, Сопредседатель культуры с клеточных линий, выражая цель антигена можно assayed анализируя супернатанта содержимое с помощью ИФА. Отношение автомобилей Т-клеток в клетки-мишени и продолжительность периода совместного культуры должны быть оптимизированы для каждой конструкции автомобилей, целевой ячейки линии и исследуемое вещество. PMA и ionomycin лечение может использоваться как позитивный элемент управления для подтверждения качества Т-клеток и их способности реагировать. 5. оценить деятельность анти-рак у мышей Протокол 1 Выполните 100 мг/кг внутривенно (IV) доставки циклофосфамид в мышей BALB/c 6-8 недель. Это позволяет приживления опухоли без значительных lymphodepletion17 (рис. 4).Примечание: Создание A20 лимфомы может занять более 2 месяцев с частотой субоптимальные принять. Это может быть улучшена путем использования циклофосфамида 1 день до доставки клеток лимфомы. С целью изучения lymphoreplete мышей, мы определили дозы циклофосфамид, которые могли бы повысить эффективность лимфомы не вызывая lymphodepletion. Следующий день, придать 100 мкл 5 x 105 сингенных A20 B-клеточной лимфомы клеток изменения выразить Люцифераза и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) мышей при внутривенном (IV). Разрешить мышей для разработки системных лимфомы для ~ 17 дней. Подтвердите наличие системных лимфомы, внутрибрюшинного введения (IP) в 100 мкл люциферин 30 мг/мл и изображений с помощью биолюминесценции в естественных условиях , системы. Используйте разделители, чтобы избежать распространения сигнала в прилегающих мышей. Разоблачить мышей за 1 мин на вентральной стороне с постоянным размером региона интерес. Отображение относительных единицах света (RLU) как фотоны в секунду (p/s). Параметры должны быть оптимизированы для каждой модели опухоли; Использование воздействия, что может забрать раннего выявления опухолей, но не привести к насыщенности, как опухоли достичь конечных точек. Запись всего RLU для каждой мыши с постоянным размером области интереса. (Рисунок 5a и b). Придать разовая доза 1 х 106 автомобилей Т-клеток, IV инъекции в lymphoreplete мышей с учетом установленных лимфомы.Примечание: (важно) Дозирование уровнях должны создаваться для каждого автомобиля построить, используя график эскалации дозы для обеспечения любых возможных токсичность, вытекающих из автомобилей Т-клетки характеризуются и могут быть решены. Хотя анти мыши CD19 автомобилей Т-клетки не отображать токсичность, автомобилей Т-клеток может привести к неожиданным токсичность. Там, где несколько автомобилей конструкции и электромеханической эффективности не идентичны, общее количество Т-клеток, ведении следует равных путем добавления Т-клеток, не преобразованы в ячейку препаратов. Контролировать прогрессирование заболевания еженедельно через IP инъекции 100 мкл люциферин 30 мг/мл и изображений с помощью биолюминесценции в естественных условиях , визуализации системы (рис. 5 c). Внимательно следить за мышей признаки токсичности и усыпить мышей, которые показывают первые признаки задних конечностей паралич (ГВУ) или патологических опухоли бремя до любого страдания могут возникнуть.Примечание: Токсичность от A20 лимфомы могут включать паралич задних конечностей через прорастание опухоли мозговых оболочек. Регулярно проверяйте для ранних признаков измененных походки. Кроме того большие опухоли IP могут возникнуть, что может привести к дискомфорту, свидетельствует измененное поведение. Следить за выживание мышей для 60-100 дней (рис. 5 d). Выполняют euthanasia методом график-1 после завершения эксперимента. Протокол 2 Доставить циклофосфамида 200 мг/кг 6-8 – неделя старый мышей BALB/c впрыской хвост вен в 100 мкл PBS на мышь. На следующий день придать 5 x 105 сингенных A20 B-клеточной лимфомы клеток выразить Люцифераза и гена GFP в 100 мкл PBS через хвост инъекции Вену. Разрешить мышей для разработки системных лимфом для ~ 7-14 дней Подтвердите системных лимфомы, IP инъекции 100 мкл люциферин 30 мг/мл и изображений с помощью биолюминесценции в естественных условиях , визуализации системы. Выполните 5 гр тотальное облучение тела (TBI) 0,02 гр/мин для lymphodepletion.Примечание: Пациенты проходят лечение автомобилей Т-клеток пройти целый ряд схем для достижения lymphodepletion, прежде чем администрация автомобилей Т-клеток, которые значительно увеличивает приживления из восприимчивую переведены автомобилей Т-клеток. Это может быть воспроизведена в мышей с облучение всего тела (TBI) (рис. 6). На следующий день придать 1 х 106 автомобилей Т-клеток в 100 мкл PBS через хвост вен инъекции в мышей с учетом установленных опухолей. Сбор проб крови через хвост вен кровоточит после 7 дней. Добавьте буфер lysis клетки красного каждого образца крови, а затем подготовить для проточной цитометрии, как описано в разделе 3. Анализ автомобилей T сохранение клеток в циркуляции подачей cytometry (рис. 2).Примечание: Добавление подсчета бусины непосредственно перед цитометрии позволяет определять количество автомобилей Т-клеток на миллилитр крови. Ходом болезни, как описано в шагах 5.1.5 – 5.1.8 (рис. 7).