同系マウス B 細胞リンパ腫モデル CD19 車 T 細胞の前臨床評価

すべての動物実験を行った動物 (科学的なプロシージャ) の行為 1986 の後援の下、英国の調整委員会の下でがん研究のガイドラインについてすべての動物の研究が CRUK マンチェスター研究所で行われ、動物愛護が承認、倫理審査体 (CRUK MI AWERB)。 1. 準備 Maxiprep pMP71 レトロ ウイルスは、プラスミッドおよび pCL エコ レトロ包装プラスミド18を構築します。注: pMP71 は、mCherry と FMDV2A のシーケンスで区切られた車をエンコードします。これは他のレトロ ウイルスの構造に置き換えられます。pCL-エコは、ギャグ、ポルとマウス白血病ウイルスエンベ エンベロープ蛋白質をエンコードします。 RPMI 1640 媒体、10 s、1 0 x ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (PSG) を用いたマウス T 細胞を培養するための完全な T 細胞用培地 (TCM) を準備します。注:ソリューションに含まれる 100 IU/mL ペニシリン、ストレプトマイシンの 100 μ g/mL と L グルタミンの 2 mM)、50 μ M β-メルカプトエタノール、25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)。 0.05 mM β-メルカプトエタノール 37 ° c、5% CO210% FCS RPMI 1640 A20 の細胞を培養します。 5% 完全なダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) (10% ウシ胎仔血清 (FCS)、2 mM 1 G/ml ピューロマイシンと 10 μ g/mL ブラストサイジン L-グルタミンを DMEM) 37 ° c でプラチナ E (ぷらっと-E) 細胞の培養 CO2.注:ぷらっと-E 細胞 293 t 細胞由来し、ギャグ、ポルとマウス白血病ウイルスエンベ封筒レトロ ウイルス蛋白質を表現します。 トランスフェクション メディア ソリューション 1、トランスフェクションの直前に 2 を準備します。解決策 1 (pH 7.9) DMEM + 10 s + 25 mM HEPES、ソリューション 2 (pH 7.1) DMEM + 25 mM HEPES を含むを格納する準備をします。 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈することによって 10 G/ml 組換え人間フィブロネクチン フラグメント ソリューションを準備し、使用するまで-20 ° C で保存します。 無菌 (除く組換え人間フィブロネクチン フラグメント) を使用する前に 0.2 μ m のフィルターを通してすべてのメディアをフィルターします。 2 T 細胞のレトロ ウイルスの伝達 1 日目: 準備の transfection のため シード 7.5 x 106プラチナ E (ぷらっと-E) 完全な DMEM の 18 mL で 15 cm2ティッシュの培養皿の細胞し、37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。 2 日目: Plat E レトロ包装細胞のトランスフェクション Pcl-エコ包装ベクトル DNA をトランスフェクションするプラスミド DNA エンコード レトロ車構成および 1 M CaCl2 15 cm2皿あたり 3 mL トランスフェクション ソリューション 2 の最終巻の 150 μ L の 39.6 μ g の 20.4 μ g を準備します。10 s および 5 分のための残りの渦 15 cm2料理から DMEM メディアを削除し、12 トランスフェクション溶液 1 mL に置き換えます。注意メディアを変更すると、15 cm2皿がセンターで乾燥することができます。ぷらっと-E transfected セルの実質的な死があります。迅速作業し、同時にちょうど 1-2 のプレートからメディアを削除します。 3 mL トランスフェクション ソリューション各プレートの間で drop-wise、均等に各 15 cm2皿に DNA および CaCl2を含む 2 を追加します。37 ° C、5% CO2一晩で 10 s. 加温の左右に動きで優しくロック プレートです。 3 日目: 準備のウイルスを含む伝達の上清 置換 18 ml transfected プレート E セルのメディアは TCM を完了し、インキュベーターに戻る。注意ときメディア 15 cm2料理を変更すると、センターで乾燥することができます。ぷらっと-E transfected セルの実質的な死があります。迅速作業し、同時にちょうど 1-2 のプレートからメディアを削除します。 マウス脾臓細胞の 3 日目: 分離との in vitro活性化 パーキンソンらによって前述したように 6-8 週齢 BALB/c マウスから脾臓を削除します。19でそれらを浸すと滅菌、氷冷、50 mL の円錐管に PBS。 1.5 mL 遠心チューブに脾臓を転送し、最小限の力で杵を使用して均質化するピンセットを使用します。 1000 μ L ピペットを使用して、~ 5 mL 単一細胞懸濁液を達成するために PBS を含む 50 mL のチューブに貼付 100 μ m 孔セル ストレーナーに磨砕液を転送する 800 μ L の PBS。追加の脾臓の 2.4.2 のステップを繰り返します。チューブあたり 3 脾臓を超えないようにします。注意左立っている場合、フィルターを通した脾細胞は塊を形成できます。細胞凝集を避けるためにいくつかの脾臓を処理する場合チューブを断続的に手動で旋回します。残りのセル ストレーナーにフラグメントことができますさらにマッシュ最小限の力を利用して 5 mL シリンジからのプランジャーを使用しています。 最大 20 mL の PBS でトップします。20 mL 50 mL のチューブで密度勾配メディア (材料表) の上に優しく 20 mL 細胞懸濁液を層します。適用ないブレーキで 20 分間 800 x g で結果のオーバーレイされる懸濁液を遠心します。 滅菌パスツール ピペットと 50 mL のチューブへの転送を使用してインターフェイス層で細胞を採取します。トップ最大 50 mL の PBS と 10 分間 800 × g で遠心分離を洗浄します。上澄みを廃棄し、再、完全な TCM のセルを中断します。 診断を使用してセルの数をカウントします。 30 ng/mL 抗 CD3ε 抗体を用いた完全な TCM の 5 x 106セル/ml の密度で細胞の培養 (145-2 C 11 のクローン)、30 ng/mL 抗 CD28 抗体 (クローン 37.51)、100 U/mL 組換えヒト IL-2 ng/mL の 2 遺伝子組換えマウスの IL-7。セル収穫量に適切なサイズの組織培養のフラスコを使用します。注:-抗原提示細胞抗体付きコート板必要があるそれを精製した T 細胞を用いた作業は、CD28 と CD3 抗体による T 細胞の活性化に必要なまたは磁気ビーズ (資材表) を使用 37 ° c、5% CO2一晩マウス脾細胞を孵化させなさい。 3 日目: 準備板の伝達 コート非培養 6 ウェル プレート 2 ml 10 G/ml 組換え人間フィブロネクチンのフラグメントし、4 ° C で一晩インキュベート 4 日目: マウス T 細胞の伝達 新鮮な非培養 6 ウェル プレートにコーティング プレートから遺伝子組換えの人間フィブロネクチン フラグメントを転送します。伝達の第 2 ラウンドの 4 ° C で一晩のこれらの版を孵化させなさい。 オリジナル組換え人間フィブロネクチン フラグメント コーティング プレートの各ウェルに TCM の 2 mL を追加し、非特異的結合をブロックするために室温で 30 分のまま。 15 cm ティッシュの培養皿の完全な TCM の 18 mL 置換 transfected Plat E セルからレトロ ウイルスを含む上清を収穫します。注意ぷらっと-E 細胞の乾燥を避けるために迅速に動作します。注:トランスフェクションの成功は、mCherry (図 1) などの蛍光マーカー遺伝子を利用した場合に、蛍光顕微鏡でこの段階で確認できます。 細胞の残骸を削除する 0.45 μ m のフィルターを通してレトロ ウイルスを含む上清をフィルターします。組換えひとフィブロネクチン フラグメント コーティング 6 ウェル プレートから TCM を削除し、フィルター処理されたレトロ ウイルスを含む上清の各ウェルに 2.5 mL を追加 (使用模擬 transfection のために完了する TCM)。レトロ ウイルスや模擬メディアの追加、各ウェルにラベルを付けます。 室温で 30 分間 1200 x g でプレートを遠心します。 プレートが回転しながら、活性化 T 細胞を収集し、診断を数えます。 伝達は 5 mL/ウェルの合計で 5 x 106アクティブ脾細胞を用いて実施されます。5 分 500 × g で遠心分離によっての個別のチューブでモック/伝達の脾細胞の必要な数をペレットします。 再陰性対照としてステップ 2.6.4 からフィルター処理されたレトロ ウイルスを含む上清の 2.5 mL あたり 5 x 10 の6セルの密度で脾細胞または TCM を中断します。組換えヒト IL-2 (hIL-2) と IL-7 (mIL-7) 遺伝子組換えマウスを最終濃度 200 IU/mL と 4 ng/mL にそれぞれ追加します。 2.6.5 のステップの完了時に遠心から 6 ウェル プレートを収集し、5 mL の最終巻/よく適切な井戸と 100 の U/mL hIL-2 および 2 ng/mL ミル-7 の最終的な集中に 2.5 mL/井戸再懸濁の脾細胞を追加します。 室温で 90 分 1200 x g でプレートを遠心します。遠心分離の後 37 ° C、5% CO2一晩で版を孵化させなさい。 5 日目: 伝達のラウンド 2 これは再利用することができます、プレートから遺伝子組換えの人間フィブロネクチン フラグメントを収集します。2.6.2 – 2.6.5 の手順を繰り返します。 プレートが回転しながら、パスツール ピペットを使用して伝達のラウンド 1stから細胞を収集します。2 ml の PBS 各ウェルを洗浄、旋回し、各ウェルで残りのセルを収集します。注:再沈殿細胞を中断する上下のピペットします。個別のチューブ内の各コントロール/伝達グループを収集します。 200 IU/mL IL-2 と 4 ng/mL IL-7 の伝達の井戸あたり 2.5 mL で 5 分再中断セル 500 × g で遠心チューブ。2.6.7 – 2.6.8 の手順を繰り返します。 遠心分離機からセルを削除し、37 ° c、5% CO2 4h 収集導入手順 2.7.2-2.7.3 のように細胞間加温します。 セルをカウント、5 分 500 × g で遠心分離機および再 100 U/mL hIL-2 2ng/mL と 1 x 106セル/ml の密度で完全な TCM で中断ミル-7。適切な規模の培養フラスコに移し、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。 新鮮な TCM メディア 100U/mL hIL 2 と 2ng/mL を含む追加ミル 7 2 日ごと 1 x 106セル/mL の細胞密度を維持します。注:収穫した脾細胞には、さまざまな種類の細胞が含まれています。これらの培養条件下以外の T 細胞は 2-3 日間にわたってオフに死にます。後 〜 細胞培養 4 日間 T 細胞数は 0 日目に通常収穫された脾細胞数の合計に相当します。 3. 伝達効率の測定 4 日目記事伝達に導入されたまたは非導入 T 細胞 (約 3 x 10 の5セル) のサンプルを収集します。500 x g で 5 分で細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを廃棄、小球形にされた PBS で 1 回洗浄し、再び遠心分離機します。 上澄みを廃棄し、適切なアミン反応性染料 (例えば、ライブ/死者の汚れ、1 の 100 倍希釈液) ウェルあたりを含む pbs 100 μ L を追加します。暗闇の中で室温で 15 分間インキュベートします。 PBS で 2 回洗うし、500 x g で 5 分間破棄上清の遠心分離機を FACS バッファー (1 の 100 倍希釈液) をブロック Fc 受容体抗マウス CD16/CD32 抗体を含む 50 μ l インキュベートします。4 ° C で 10 分間インキュベートします。 抗マウス BV786 CD4 と CD8 BV711 抗体 (FACS バッファーに 1 μ L/ウェルの最終濃度) を含むマスター ミックスを汚す抗体の 50 μ L を直接追加します。暗闇の中で 4 ° C で 30 分間インキュベートします。3.3 洗浄手順を繰り返します。1 %pfa バッファー内セルを再停止し、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C で暗闇の中。 CD4 および CD8 のサブセットと (図 2) のようにそれぞれゲート車式のマーカーとして BV711、BV785、mCherry の蛍光を使用して同等の適した cytometer で細胞を分析します。 4.体外検証車 T 細胞活性 同系種対象 CD19+腫瘍細胞密度で 100 μ L で 1 x 10 の4セルのルシフェラーゼ発現の有無 TCM/96 ウェルの U 底によく組織培養プレート。 ターゲット (E:T) 比が 1:1 にエフェクターを達成するために 100 μ L/ウェルのボリュームで 1 × 104 CD19 車 T 細胞/ウェルを追加します。注:E:T 比を確立する必要がありますそれぞれの車を構築し、細胞をターゲットします。 使用 T 細胞と腫瘍細胞陰性対照として単独で、フォルボールエステル (PMA) で刺激した T 細胞 (50 ng/mL) とインターフェロン γ (肝腎) リリースのための肯定的な制御としてイオノマイシン (1 μ g/mL)。37 ° c、5% CO2 16-24 時間の培養細胞。 共培養後 5 分 500 x g でプレートを遠心し、さらに肝腎と IL-12 p 70 ELISA 分析上清を収集します。注:これは-80 ° C で保存できます。 再のルシフェリン (1.5 mg/mL の最終濃度) を含む PBS 100 μ l 細胞ペレットを中断します。37 ° C で 10 分間の版を孵化させなさい適したルミノの各ウェルからの発光を測定しなさい。注:露光時間は、細胞の密度最適化されなければなりません。代表的な結果を図 3 aに示します。車 T 細胞の細胞毒性のEx vivoは、ターゲット抗原を発現する細胞と共培養による特急ルシフェリンに変更できます。車の T 細胞は、標的細胞を殺すため、ルシフェリンがリリースされる、したがって luminometry 信号の減少は細胞死と相関します。非導入細胞はしばしば長い潜伏期間特にターゲット細胞生存率に及ぼす影響を持つことができます。製造元の ELISA のプロトコルによると清のマウスの肝腎と IL-12 p 70 の濃度を測定します。代表的な結果は、(図 3 b 3 c) に表示されます。ターゲット抗原を発現する細胞との共培養による車の T 細胞の体外活性化は、elisa 法を用いた培養上清中の内容を分析することによって試金することができます。標的細胞車 T 細胞の比率と共培養期間の長さは、車構成、ターゲット細胞ラインおよび検体の最適化されなければなりません。PMA およびイオノマイシン治療は、T 細胞と対応する能力の品質を確認する肯定的な制御として使用できます。 5. マウスで抗腫瘍活性を評価します。 プロトコル 1 シクロホスファミドの 6-8 週 BALB/c マウスに静脈内 (IV) 配信を 100 mg/kg を実行します。これにより、腫瘍生着せず重要な lymphodepletion17 (図 4)。注:A20 を確立するリンパ腫は、最適率で 2 ヶ月以上かかります。これは、リンパ腫細胞の配信前に 1 日シクロホスファミドの使用によって改善できます。Lymphoreplete マウスを研究するために lymphodepletion を発生させることがなくリンパ腫の効率を上げることができるシクロホスファミドの投与量を同定しました。 次の日、マウス静脈内 (IV) 注射で 5 × 105同系 A20 B 細胞リンパ腫細胞ルシフェラーゼと緑の蛍光蛋白質 (GFP) を表現する変更の 100 μ L を注入します。 全身のリンパ腫を開発するマウスを許可する 〜 17 日。 100 μ L 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム体内の発光イメージングの腹腔内 (IP) 投与による全身リンパ腫の存在を確認します。 隣接するマウスに信号の波及を避けるために区切り記号を使用します。興味の一定の大きさで分類された地域と腹側に 1 分のマウスを公開します。 (P/秒) 光子として相対的なライト ユニット (RLU) を表示します。各腫瘍モデルの設定を最適化する必要があります。腫瘍の早期発見を拾うことができますが、腫瘍のエンドポイントに達すると飽和にはつながらない露出を使用します。 定数と各マウスのレコードの合計 RLU 関心領域のサイズ。(図 5 aとb)。 確立された軸受 lymphoreplete マウスに静脈注射による 1 x 106車 T 細胞の単回投与リンパ腫を注入します。注: (重要)レベルを投与する必要があります確立ごと車建設車 T 細胞から生じるすべての可能な毒性の特徴は、対処できることを確保するため線量エスカレーション スケジュールを使用しています。抗マウス CD19 車 T 細胞に毒性が表示されないが、車 T 細胞は予期しない毒性に上昇を与えることができます。ここで複数の車の構成要素と伝達効率が同一ではない T 細胞投与の合計数おきましょう等しいセル準備に T 細胞の非導入の付加によって。 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム (図 5 c)体内の発光イメージングの毎週 100 μ L の IP 注射を通して病気の進行を監視します。 密接に毒性の印をマウスを監視し、任意の苦しみが生じる前に、後肢麻痺 (HLP) または病理学的腫瘍負荷の初期の兆候を示すマウスを安楽死させます。注:A20 リンパ腫から毒性は、髄膜の腫瘍浸潤による後肢麻痺を含めることができます。変更された歩行の初期の兆候を定期的にチェックします。同様に、大規模な IP の腫瘍は、行動変化によって示されている不快感につながることができますが発生します。 60-100 日間 (図 5 d) のマウスの生存率を監視します。実験の結論にスケジュール 1 法による安楽死を実行します。 プロトコル 2 6 には、8 週間の古い BALB/c マウス尾静脈注射 100 μ L の PBS のマウスごとに 200 mg/kg のシクロホスファミドを提供します。 次の日に 5 × 105同系 A20 B 細胞リンパ腫細胞 100 μ L PBSで尾静脈注射で GFP とルシフェラーゼを表現するを注入します。 全身のリンパ腫を開発するマウスを許可する 〜 7-14 日 IP 30 mg/mL ルシフェリン ・ イメージング システム体内の発光イメージングの 100 μ L 注入して全身のリンパ腫を確認します。 Lymphodepletion 0.02 Gy/分 5 Gy 全身照射 (TBI) を実行します。注:車 T 細胞治療を受けている患者を受ける車 T 細胞に対しての生着が大幅増加の管理転送車 T 細胞前に lymphodepletion を達成するために療法の範囲。これは、総ボディ照射 (TBI) (図 6) を持つマウスでレプリケートできます。 次の日に 100 μ L の PBSで尾静脈設立軸受マウス注入腫瘍で 1 x 106トン車のセルを挿入します。 7 日後血液サンプルで尾静脈出血を収集します。 各血液サンプルに赤セル換散バッファーを追加し、セクション 3 で説明したようにフローサイトメトリーの準備します。フローサイトメトリー (図 2) によって循環の車 T 細胞の永続性を分析します。注:フローサイトメトリー直前カウント ビーズの血液 1 ミリリットルあたり車 T 細胞数の決定できます。 5.1.5 – 5.1.8 (図 7) の手順で説明するよう、病気の進行状況を監視します。