Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

Alle Tierversuche wurden unter der Schirmherrschaft der Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986 und UK Coordinating Committee für Krebsforschung Richtlinien durchgeführt. Alle Tierversuche durchgeführt am Institut CRUK-Manchester und genehmigt durch die lokalen Tierschutz und Ethik überprüfen Körper (CRUK-MI-AWERB). 1. Vorbereitungen Maxiprep pMP71 retrovirale konstruieren Plasmid und pCL-Eco Retrovirus Verpackung Plasmide18.Hinweis: pMP71 kodiert, mCherry und das Auto durch eine FMDV2A Sequenz getrennt. Dies ist austauschbar mit anderen retroviralen Konstrukten. pCL-Eco kodiert Gag, Pol und die Ecotropic Umschlag Proteine. Bereiten Sie komplette T-Zell-Medium (TCM) für die Kultivierung von Maus-T-Zellen mit RPMI 1640 Medium, 10 % FCS, 1 % 100 X Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG).Hinweis: Die Lösung enthält 100 IE/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), 50 μM β-Mercaptoethanol und 25 mM 4–(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES). Kulturzellen Sie A20 in RPMI 1640, 10 % FCS und 0,05 mM β-Mercaptoethanol bei 37 ° C, 5 % CO2. Kultur der Platin-E (Plat-E) Zellen in komplette Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) (DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 μg/mL Puromycin und 10 μg/mL Blasticidin) bei 37 ° C, 5 % CO2.Hinweis: Plat-E Zellen stammen aus 293T Zellen und express Gag, Pol und Ecotropic Umschlag retrovirale Proteine. Bereiten Sie Transfektion Medienlösungen 1 und 2 unmittelbar vor Transfektion. Bereiten Sie Lösung 1 (pH 7,9) enthalten DMEM + 10 % FCS + 25 mM HEPES, Lösung 2 (pH 7,1) enthalten DMEM + 25 mM HEPES vor. Bereiten Sie 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lösung durch Verdünnung mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Steril alle Filtermedien durch 0,2 μm-Filter vor der Verwendung (ausgenommen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment). (2) retrovirale Transduktion von T-Zellen Tag 1: Vorbereitung zur Transfektion Samen 7,5 x 106 Platin-E (Plat-E) Zellen in 15 cm2 Gewebekultur Gerichte in 18 mL komplette DMEM und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2. 2. Tag: Transfektion von Plat-E retrovirale Verpackung Zelllinie Bereiten Sie 20.4 μg des Pcl-Eco Verpackung Vektor-DNA, 39,6 µg Plasmid-DNA Kodierung retrovirale Auto Konstrukt und 150 μL 1 M CaCl2 zu Endvolumen von 3 mL Transfektion Lösung 2 je 15 cm2 Teller transfiziert werden vor. Wirbel für 10 s und 5 min ruhen lassen Die 15 cm2 Gerichte DMEM Medien entnehmen und ersetzen mit 12 mL Transfektion Lösung 1.Vorsicht Wenn die Medien verändert, können die 15 cm2 Gerichte in der Mitte trocknen. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu. Fügen Sie 3 mL Transfektion Lösung 2 mit DNA und CaCl2 um jeweils 15 cm2 Teller tropfenweise, gleichmäßig auf jeder Platte. Schütteln Sie Platten mit einer Seite zur anderen Bewegung für 10 S. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht. Tag 3: Vorbereitung der Virus-haltigen überstand für die Transduktion Ersetzen Sie die Medien von transfizierten Zellen der Platte-E mit 18 mL komplette TCM zurück zum Inkubator.Vorsicht Wenn wechselnde Medien 15 cm2 Gerichte in der Mitte trocknen kann. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu. Tag 3: Isolierung und in-vitro- Aktivierung der Milz T Mauszellen. 6-8-Woche-alten BALB/c Mäuse wie oben beschrieben durch Parkinson Et Al. entfernen Sie Milz 19 und tauche sie in sterile, eiskalt, PBS in einer 50 mL konische Röhre. Benutzen Sie eine Pinzette Milz auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen und mit einem Stößel mit minimalem Kraftaufwand zu homogenisieren. Verwenden eine 1000 μl Pipette und ~ 800 μl PBS übertragen Homogenat auf einem 100 μm Pore Zelle Sieb angebracht, um eine 50 mL-Tube mit 5 mL PBS, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erreichen. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2 für zusätzliche Milz. Überschreiten Sie 3 Milz pro Röhre nicht.Vorsicht Splenocyten Filter durchlaufen können Klumpen bilden, bleibt stehen. Manuell schwenken Röhren zeitweise wenn mehrere Milz zur Vermeidung von Zelle Verklumpung zu verarbeiten. Verbleibenden Fragmente auf der Zelle-Sieb kann weiter mit einem Kolben aus einer 5 mL Spritze mit minimalem Kraftaufwand püriert werden. Top-bis zu 20 mL mit PBS. Schicht der 20 mL Zellsuspension sanft auf 20 mL Dichte Gradienten Medien (Table of Materials) in einem 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden überlagerte Aussetzung bei 800 X g für 20 min mit keine Bremse. Zellen mit einem sterilen Pasteurpipette und Transfer in ein 50 mL-Tube-Schnittstellenschicht zu ernten. Top-bis zu 50 mL mit PBS und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min waschen. Verwerfen Sie den überstand und erneut aussetzen Sie Zellen in der kompletten TCM. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Kulturzellen bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen/mL in der kompletten TCM mit 30 ng/mL Anti-CD3ε Antikörper (Klon 145-2 C 11), 30 ng/mL Anti-CD28 Antikörper (Klon 37,51), 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2 und 2 ng/mL rekombinante murine IL-7. Verwenden Sie eine entsprechend dimensionierte Gewebekultur Kolben für das Volumen der Zellen geerntet.Hinweis: –Antigenpräsentierende Zellen sind erforderlich für den T-Zell-Aktivierung von CD3 und CD28 Antikörper, wenn arbeiten mit gereinigten T Zellen es Mantel Platten mit Antikörpern erforderlich ist, oder verwenden Sie magnetische Beads (Table of Materials) Inkubieren Sie Maus splenocyten bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht. Tag 3: Vorbereitung der Platten für die Transduktion Mantel-Gewebekultur 6-Well-Platten mit 2 mL 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin fragmentieren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren 4. Tag: Transduktion von Maus-T-Zellen Übertragen Sie rekombinante menschliche Fibronektin Fragment von beschichteten Platten auf frischen Gewebekultur 6-Well-Platten. Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 4 ° C für Runde 2 der Transduktion. 2 mL der TCM in jede Vertiefung der ursprünglichen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment-beschichteten Platten und lassen für 30 min bei Raumtemperatur, unspezifischen Bindung zu blockieren. Retrovirus-haltigen überstand von transfizierten Zellen der Plat-E in 15 cm Gewebekultur Gerichte und ersetzen mit 18 mL komplette TCM zu ernten.Vorsicht Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, Trocknen von Plat-E Zellen.Hinweis: Erfolg der Transfektion kann in diesem Stadium durch Fluoreszenz-Mikroskopie überprüft werden, ob eine fluoreszierende Marker-gen wie mCherry (Abbildung 1) zu nutzen. Filtern des Retrovirus-haltigen Überstands durch 0,45 μm-Filter, Zelle Ablagerungen zu entfernen. TCM von rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment beschichtet 6-Well Platten zu entfernen und 2,5 mL gefilterte Retrovirus-haltigen überstand oder in jede Vertiefung (Nutzung komplett TCM zur mock Transfektion). Beschriften Sie jedes gut, die Zugabe von Retroviren oder mock Medien. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 30 min bei Raumtemperatur. Während Platten drehen, aktivierte T-Zellen zu sammeln und zählen mit einem Hemocytometer. Transduktion erfolgt mit 5 x 106 aktiviert splenocyten in insgesamt 5 mL/gut. Pellet-die erforderliche Anzahl von splenocyten für Mock/Transduktion in getrennten Rohren durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 Minuten. Wieder aussetzen Sie splenocyten bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen pro 2,5 mL des gefilterten Retrovirus-haltigen überstand aus Schritt 2.6.4 oder TCM als Negativkontrolle. Fügen Sie rekombinanten menschlichen Il-2 (hIL-2) und rekombinanten Maus IL-7 (mIL-7), eine Endkonzentration von 200 IU/mL und 4 ng/mL bzw.. Sammeln Sie 6-Well Platten aus der Zentrifuge nach Abschluss von Schritt 2.6.5 zu und fügen Sie 2,5 mL/Brunnen neu abgehängte splenocyten in entsprechenden Vertiefungen zu machen ein Finales Volumen von 5 mL/gut und eine Endkonzentration von 100 U/mL hIL-2 und 2 ng/mL mIL-7. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 90 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nach Zentrifugation die Platten bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht. 5. Tag: Runde 2 der Transduktion Das rekombinante menschliche Fibronektin-Fragment von den Platten zu sammeln, wie diese wiederverwendet werden kann. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.2 – 2.6.5. Während Platten drehen, sammeln Sie Zellen von der 1St Runde Transduktion mit einer Pasteurpipette. Spülen Sie jedes gut mit 2 mL PBS, Wirbeln Sie und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen in jede Vertiefung.Hinweis: Pipette rauf und runter um sedimentierten Zellen wieder auszusetzen. Sammeln Sie jede Kontrolle/Transduktion Gruppe in getrennten Rohren. Zentrifuge Rohre bei 500 X g für 5 min. wieder auszusetzen Zellen in 2,5 mL pro Bohrloch der Transduktion mit 200 IU/mL IL-2 und 4 ng/mL IL-7. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.7 – 2.6.8. Entfernen Sie die Zellen aus der Zentrifuge und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 4 Std. sammeln ausgestrahlt Zellen wie in den Schritten 2.7.2-2.7.3. Zählen der Zellen, bei 500 X g für 5 min zentrifugieren und wieder auszusetzen in der kompletten TCM bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/mL mit 100 U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7. Übertragen auf eine entsprechend dimensionierte Kultur Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2. Hinzufügen von frischen TCM-Medien enthält 100U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7 alle 2 Tage, Aufrechterhaltung einer Zelldichte von 1 x 106 Zellen/mL.Hinweis: Geerntete splenocyten enthalten eine Vielzahl von Zelltypen. Unter diesen Kulturbedingungen nicht T-Zellen Absterben im Laufe von 2-3 Tagen. Nach ~ 4 Tage in der Zellkultur, die Anzahl der T-Zelle ist in der Regel entspricht die Gesamtzahl der geernteten splenocyten am Tag 0. 3. Messung der Transduktion Effizienz Am 4. Tag Post Transduktion sammeln Sie eine Probe des ausgestrahlt oder nicht ausgestrahlt T-Zellen (ca. 3 x 105 Zellen). Die Zellsuspension bei 500 X g für 5 min zentrifugieren, überstand verwerfen, gebeizte Zellen einmal mit PBS waschen und wieder Zentrifugieren. Den überstand verwerfen und 100 μl PBS mit einem geeigneten Amin Reaktivfarbstoffen(z. B.lebenden/Toten Fleck, 1: 100 Verdünnung) pro Bohrloch hinzufügen. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Zweimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min. überstand verwerfen und inkubieren Sie mit 50 μL der FACS-Puffer mit Anti-Maus-CD16/CD32 Antikörper für Fc-Rezeptor blockieren (1: 100 Verdünnung). 10 min bei 4 ° c inkubieren Direkt hinzugefügt werden 50 μL des Antikörpers Färbung master-Mix mit Anti-Maus CD4-BV786 und CD8-BV711 Antikörper (Endkonzentration von 1 μl/Well in FACS-Puffer). 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren. Wiederholen Sie die Waschschritt 3.3. Zellen in 1 % PFA Puffer wieder auszusetzen und halten die im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie. Analysieren Sie Zellen mit gleichwertigen geeignet Cytometer mit BV711, BV785 und mCherry Fluoreszenz als Marker für CD4 und CD8 Teilmenge und Auto Ausdruck bzw. gating wie in (Abbildung 2). 4. in-vitro- Validierung von Auto T-Zell Aktivität Samen Phänomen gezielt CD19+ Tumorzellen mit oder ohne Luciferase Ausdruck bei einer Dichte von 1 x 104 Zellen in 100 μl TCM/Brunnen in einer 96-Well U-Boden Gewebekultur Platte. Fügen Sie 1 x 104 CD19 Auto T Zellen/Brunnen in einem Volumen von 100 μl/Well, ein Effektor Ziel (E:T)-Verhältnis von 1:1 zu erreichen.Hinweis: E:T Kennzahlen festgelegt werden für jedes Auto zu konstruieren und gezielt Zelllinie. Allein Verwendung T-Zellen und Tumorzellen allein als Negativkontrollen und T-Zellen angeregt durch Phorbol-Myristate-Acetat (PMA) (50 ng/mL) und Ionomycin (1 μg/mL) als Positivkontrolle für Interferon Gamma (IFNγ) Version. Kokultur Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 für 16-24 h. Nach kokultur die Platten 500 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand für weitere IFNγ und IL – 12 p 70 ELISA Analysen zu sammeln.Hinweis: Dies kann bei-80 ° c gelagert werden Wieder auszusetzen Sie Zelle Pellets in 100 μl PBS mit Luciferin (Endkonzentration von 1,5 mg/mL). Inkubieren Sie die Platten für 10 min bei 37 ° c Messen Sie dann die Lumineszenz aus jedem Brunnen mit einem geeigneten Luminometer.Hinweis: Belichtungszeiten müssen für Zell-Linien und Dichte optimiert werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3agezeigt. Ex-Vivo Zytotoxizität von Auto-T-Zellen kann auf ausdrücklichen Luciferin von Kokulturen mit Zelllinien mit dem Ziel Antigen Ausdruck geändert werden. Wie Auto-T-Zellen Zielzellen töten, Luciferin freigesetzt wird, daher ist ein Rückgang der Luminometry Signal korreliert mit Zelle zu töten. Non-ausgestrahlt Zellen können oft auf Ziel Zellviabilität, besonders über langen Inkubationszeiten auswirken. Messen Sie die Konzentration von murinen IFNγ und IL – 12p 70 im überstand entsprechend des Herstellers ELISA Protokollen. Repräsentative Ergebnisse erscheinen (Abb. 3 b und 3 c). Ex-Vivo -Aktivierung des Auto-T-Zellen durch kokultur mit Zelllinien mit dem Ausdruck ihrer Ziel-Antigen kann durch die Analyse überstand Inhalte mittels ELISA untersucht werden. Das Verhältnis von Auto-T-Zellen auf Zielzellen und Dauer der kokultur müssen für jedes Auto-Konstrukt, Ziel-Zell-Linie und Analyten optimiert werden. PMA und Ionomycin Behandlung kann als Positivkontrolle verwendet werden, um Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zur Reaktion zu bestätigen. 5. Anti-Krebs-Aktivität bei Mäusen zu beurteilen. Protokoll Nr. 1 Durchführen Sie 100 mg/kg intravenös (IV) Lieferung von Cyclophosphamid in 6 bis 8 Wochen BALB/c Mäuse. Dies ermöglicht Tumor Engraftment ohne signifikante Lymphodepletion17 (Abbildung 4).Hinweis: A20 herstellen kann Lymphom mit einer suboptimalen Take Rate mehr als 2 Monate dauern. Dies kann durch den Einsatz von Cyclophosphamid 1 Tag vor der Lieferung der Lymphom-Zellen verbessert werden. Um Lymphoreplete Mäuse zu studieren, haben wir eine Dosis von Cyclophosphamid, die Effizienz des Lymphoms erhöhen könnte, ohne dass Lymphodepletion identifiziert. Injizieren Sie am nächsten Tag 100 µL 5 x 105 Phänomen A20 B-Zell Lymphom-Zellen geändert, um Luciferase und grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Ausdrücken in Mäusen durch intravenöse (IV) Injektion. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 17 Tage. Bestätigen Sie die Anwesenheit von systemischen Lymphomen durch intraperitoneale (IP) Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System. Verwenden Sie Separatoren Signal Spillover in angrenzenden Mäuse zu vermeiden. Setzen Sie Mäuse für 1 min auf der Bauchseite mit einer Konstanten Größe Region von Interesse. Relative light Units (RLU) als Photonen pro Sekunde (p/s) anzeigen. Einstellungen müssen für jeden Tumor Modell optimiert werden; Verwenden Sie eine Ausstellung, die Früherkennung von Tumoren abholen kann, aber führt nicht zur Sättigung, wie Tumoren Endpunkte erreichen. Rekord insgesamt RLU für jede Maus mit einer Konstanten Größe Region von Interesse. (Abb. 5a und b). Eine Einzeldosis von 1 x 106 Auto-T-Zellen durch IV Injektion in Lymphoreplete Mäuse mit etabliert-Lymphom zu injizieren.Hinweis: (wichtig) Dosierung von Ebenen muss für jede eingeführt werden, Auto zu konstruieren, mit einer Dosis Eskalation Zeitplan, damit jede möglichen Toxizitäten aus Auto-T-Zellen sind gekennzeichnet und angesprochen werden können. Obwohl Anti-Maus-CD19-Auto-T-Zellen nicht Toxizitäten angezeigt werden, können Auto-T-Zellen zu unerwarteten Toxizitäten führen. Wo mehrere Auto-Konstrukte und Transduktion Effizienz nicht identisch sind, sollte die Gesamtzahl der T-Zellen verabreicht durch die Zugabe von T-Zellen nicht ausgestrahlt in Zelle Vorbereitungen gleich gehalten werden. Überwachen Sie Krankheitsprogression wöchentlich durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System (Abbildung 5 c). Aufmerksam verfolgen Sie Mäuse auf Anzeichen von Toxizität und einschläfern Sie keine Mäuse, die frühe Anzeichen der hinteren Extremität Lähmung (HLP) oder pathologischen tumorlast zeigen, bevor alle leiden entstehen kann.Hinweis: Toxizitäten von A20 Lymphom zählen Hind Extremität Lähmung durch Tumorinvasion von der Hirnhaut. Überprüfen Sie regelmäßig Frühzeichen veränderten Gangbild. Ebenso können große IP-Tumoren entstehen, die zu Beschwerden durch verändertes Verhalten gezeigt führen kann. Überleben der Mäuse für 60-100 Tage (Abb. 5D) zu überwachen. Durchführen Sie Euthanasie durch einen Anhang-1-Methode nach Abschluss des Experiments. Protokoll Nr. 2 Liefern Sie Cyclophosphamid 200 mg/kg 6 bis 8 – Wochen alten BALB/c Mäuse durch Rute Vene Injektion in 100 μl PBS per Mausklick. Am folgenden Tag injizieren von 5 x 105 Phänomen A20 B-Zell-lymphomzellen Ausdruck Luciferase und GFP 100 μl PBS über Heck Vene injizieren. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 7-14 Tage Systemischen Lymphomen durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System zu bestätigen. Durchführen Sie 5 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) bei 0,02 Gy/min für Lymphodepletion.Hinweis: Patienten, die Auto T-Zell-Behandlungen unterziehen, eine Reihe von Therapien, um Lymphodepletion zu erreichen, bevor die Verwaltung der Auto-T-Zellen die erhöht das Engraftment des adoptively Auto T-Zellen übertragen. Dies kann bei Mäusen mit Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) (Abbildung 6) repliziert werden. Am nächsten Tag injizieren Sie 1 x 106 Auto-T-Zellen in 100 μl PBS über Heck Vene Injektion in Mäusen mit gegründet Tumoren. Sammeln Sie Blut Proben über Heck Vene blutet nach 7 Tagen. Jede Blutprobe fügen Sie rote Zelle Lysis Puffer hinzu, dann Durchflusszytometrie bereiten Sie vor, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Analysieren Sie Auto T Zelle Persistenz in der Zirkulation durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2).Hinweis: Zugabe von zählen Perlen unmittelbar vor zytometrie ermöglicht die Bestimmung der Anzahl der Auto-T-Zellen pro Milliliter Blut. Überwachen Sie Krankheit Fortschritt, wie 5.1.5 – 5.1.8 (Abbildung 7) beschrieben.