עכבר Syngeneic B-Cell לימפומה מודל להערכת קליניים בתאי T המכונית CD19

כל הניסויים נערכו תחת חסותה של המעשה חיות (וצפייה) 1986 ותחת ועדת תיאום בבריטניה לקבלת הנחיות לחקר הסרטן. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל היו שנערך במכון CRUK-מנצ’סטר ואושרו על-ידי רווחת בעלי חיים מקומיים וסקור אתיקה הגוף (AWERB CRUK-MI). 1. תכשירים Maxiprep pMP71 retroviral לבנות פלסמיד ו- pCL-Eco הרטרווירוס אריזה פלסמידים18.הערה: pMP71 מקודד mCherry והמכונית מופרדות מרצף FMDV2A. . זה להחלפה עם בונה retroviral אחרים. pCL-Eco מקודד איסור פרסום, פול פוט, החלבונים מעטפה ecotropic. היכונו culturing העכבר T תאים באמצעות RPMI 1640 בינוני, FCS 10%, 1% 100 x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (פריז סן ז’רמן) תא T שלם בינוני (TCM).הערה: הפתרון מכיל 100 IU/mL פניצילין, µg/mL 100 של סטרפטומיצין, 2 מ מ של L-גלוטמין), 50 μM β-mercaptoethanol וחומצה 25 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). תרבות בתאים A20 RPMI 1640, FCS 10% וβ-mercaptoethanol מ מ 0.05-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התרבות התאים פלטינה-E (Plat-E) של Dulbecco מלאה נשר ששונה בינוני (DMEM) (DMEM עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), 2 מ מגלוטמין, 1 μg/mL puromycin ו- blasticidin μg/mL 10) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2-הערה: Plat-E תאים נגזרים מתאי 293T ולבטא את הבדיחה, פול פוט, ecotropic מעטפה retroviral חלבוני. הכנת תקנים פתרונות מדיה 1 ו- 2 מייד לפני תרביות תאים. להכין פתרון 1 (pH 7.9) כדי להכיל DMEM + 10% FCS + 25 מ מ HEPES, פתרון 2 (pH 7.1) כדי להכיל DMEM + 25 מ מ HEPES. להכין 10 μg/mL fibronectin האנושי רקומביננטי פרגמנט פתרון על ידי דילול עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS) ולאחסן ב-20 ° C עד השימוש. סטרילי לסנן כל המדיה דרך מסננים μm 0.2 לפני השימוש (למעט קטע רקומביננטי fibronectin אנושי). 2. retroviral התמרה חושית של תאי T יום 1: הכנה תרביות תאים זרע 7.5 x 106 פלטינה-E (Plat-E) תאים במנות 15 ס מ2 תרביות רקמה ב 18 מ של DMEM מלאה, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. יום 2: תקנים של פלאט-E אריזה retroviral תא קו להכין μg 20.4 של pcl-Eco אריזה וקטור ה-DNA, μg 39.6 של DNA פלסמיד קידוד retroviral לבנות מכונית ו 150 μL של 1 מ’ CaCl2 לנפח סופי של 3 mL תרביות תאים פתרון 2 לכל מנה2 15 ס מ כדי להיות transfected. מערבולת עבור 10 s ו לנוח 5 דקות הסר DMEM מדיה של 15 ס מ2 הכלים והחלף 12 מ של תרביות תאים פתרון 1.זהירות בעת שינוי בתקשורת, יכול לייבש הכלים2 15 ס מ במרכז. זה יכול לגרום מוות משמעותי transfected תאים Plat-E. לעבוד במהירות, להסיר מדיה רק 1-2 צלחות בכל פעם. להוסיף 3 מ”ל תרביות תאים פתרון 2 המכילה DNA ו CaCl2 על כל מנה2 15 ס מ drop-wise, באופן שווה על פני כל צלחת. בעדינות לוחות אבן עם תנועה מצד לצד על Incubate ס’ 10 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה. יום 3: הכנת המכיל וירוס supernatant עבור התמרה חושית החלף המדיה של תאים בצלחת-E transfected עם 18 mL להשלים TCM ולחזור חממה.זהירות מתי לשנות את המדיה 15 ס מ2 הכלים יכול לייבש במרכז. זה יכול לגרום מוות משמעותי transfected תאים Plat-E. לעבוד במהירות, להסיר מדיה רק 1-2 צלחות בכל פעם. יום 3: בידוד, במבחנה הפעלה של תאי T הטחול העכבר הסר טחולים עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע כאמור מתוארת על ידי פרקינסון. et al. 19 , לטבול אותם סטרילי, קר כקרח, PBS צינור חרוטי 50 מ ל. השתמש פינצטה כדי להעביר על הטחול צינור microcentrifuge 1.5 mL ו- homogenize באמצעות כבעלי כוח מינימלי. להשתמש על פיפטה 1000 μL ו ~ 800 PBS μL להעביר homogenate מסננת תא נקבובית 100 μm למוט שפופרת 50 מ ל המכיל 5 מ”ל PBS להשיג השעיה תא בודד. חזור על צעד 2.4.2 טחולים נוספים. לא יעלה על 3 טחולים למחזור.זהירות Splenocytes עברו סינון יכולים ליצור גושים אם נותרו על עומדם. באופן ידני מערבולת צינורות לסירוגין אם עיבוד טחולים מספר כדי להימנע תא הצליעה. הנותרים קטעים על מסננת התא יכול עוד להמחץ בעזרת פומפה של מזרק 5 מ ל באמצעות כוח מינימלי. למעלה עד 20 מ”ל עם PBS. שכבת התליה תא 20 מ”ל בעדינות על גבי 20 מ”ל של התקשורת הדרגתיות צפיפות (טבלה של חומרים) שפופרת 50 מ. Centrifuge התליה הלשונית תוצאות ב g x 800 כעשרים דקות עם בלי בלמים מוחל. הקציר התאים בשכבת ממשק באמצעות פיפטה פסטר סטרילי העברת צינור 50 מ. למעלה עד 50 מ עם PBS, צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות לשטוף. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים ב- TCM מלאה. לספור את מספר תאים באמצעות של hemocytometer. התרבות תאים על צפיפות של 5 x 106 תאים/מ ל TCM להשלים עם 30 נוגדן anti-CD3ε ng/mL (כפיל 145-2 ג 11), 30 נוגדן anti-CD28 ng/mL (שיבוט 37.51), 100 U/mL רקומביננטי האנושי il-2, 2 ng/mL רקומביננטי מאתר IL-7. השתמש הבקבוקון של תרביות רקמה בגודל מתאים עבור אמצעי האחסון של תאים שנקטפו.הערה: תאים המציג אנטיגן–נדרשים להפעלת T-cell באמצעות נוגדנים CD3 ו- CD28, אם עובדים עם תאי T מזוכך זה יש צורך המעיל צלחות עם נוגדנים, או להשתמש beads מגנטי (טבלה של חומרים) דגירה העכבר splenocytes ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה. יום 3: הכנת לוחות עבור התמרה חושית מעיל הלא-רקמה-תרבות 6-ובכן צלחות עם 2 מיליליטר 10 μg/mL fibronectin האנושי רקומביננטי קטע, דגירה בין לילה ב 4 º C. יום 4: התמרה חושית של העכבר T תאים להעביר פרגמנט רקומביננטי fibronectin אנושי מ מצופה לוחות ללוחות 6-ובכן טריים שאינם-רקמה-תרבות. דגירה הצלחות האלה בין לילה ב 4 ° C עבור סיבוב שני של התמרה חושית. להוסיף 2 מ ל TCM כל טוב של צלחות מצופה פרגמנט רקומביננטי fibronectin האנושי המקורי ולהשאיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום את הכריכה לא ספציפית. הקציר המכילות הרטרווירוס תגובת שיקוע מתאי transfected Plat-E בהחלף מ 18 ל TCM מלאה ומנות תרביות רקמה של 15 ס מ.זהירות לפעול במהירות כדי למנוע ייבוש של תאים Plat-E.הערה: ניתן לבדוק ההצלחה של תרביות תאים בשלב זה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ אם ניצול גנים סמן פלורסנט כגון mCherry (איור 1). לסנן את תגובת שיקוע המכילות הרטרו וירוס דרך מסנן μm 0.45 כדי להסיר שאריות תאים. הסר TCM fibronectin האנושי רקומביננטי מצופים פרגמנט 6-ובכן צלחות ולהוסיף 2.5 מ של תגובת שיקוע המכילות הרטרווירוס מסוננים או מכל קידוח (שימוש להשלים TCM עבור תקנים מעושה). תווית בכל טוב עד כדי התוספת של רטרווירוס או מדיה מעושה. Centrifuge הלוחות ב g x 1200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בעוד צלחות מתחילים להסתובב, לאסוף תאי T מופעל ולספור באמצעות של hemocytometer. התמרה חושית מבוצע עם 5 x 10 splenocytes6 מופעל סך של 5 מ”ל/טוב. גלולה את המספר הנדרש של splenocytes עבור ואימץ/התמרה חושית צינורות נפרד על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות. להשעות מחדש splenocytes על צפיפות של תאים6 5 x 10 לכל 2.5 מ של מסוננים תגובת המכילות הרטרווירוס שיקוע מהשלב 2.6.4 או TCM כפקד שלילי. להוסיף רקומביננטי il-2 בני אדם (היל-2) ועכבר רקומביננטי IL-7 (mIL-7) ריכוז סופי של 200 IU/mL ו- 4 ננוגרם למ”ל בהתאמה. לאסוף. ובכן 6 צלחות לצנטריפוגה בסיום שלב 2.6.5 ולהוסיף 2.5 splenocytes mL/טוב מחדש מושעה ולס המתאימות כדי ליצור נפח הסופי של 5 מ”ל/טוב, ריכוז סופי של 100 U/mL היל-2 ו- 2 ng/mL mIL-7. Centrifuge הלוחות ב g x 1200 במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בן לילה. יום 5: 2 בסיבוב של התמרה חושית לאסוף השבר fibronectin האנושי רקומביננטי הצלחות כמו זה יכול להיות שימוש חוזר. חזור על שלבים 2.6.2 – 2.6.5. בעוד צלחות מסתובבים, לאסוף תאים 1סנט עגול של התמרה חושית באמצעות פיפטה של פסטר. לשטוף כל טוב עם 2 מ”ל PBS, מערבולת ולאסוף את כל התאים הנותרים מכל קידוח.הערה: פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש תאים sedimented. לאסוף את כל קבוצת הבקרה/התמרה חושית צינורות נפרדת. צנטריפוגה צינורות ב 500 x g עבור 5 דק להשעות מחדש תאים 2.5 מ לכל טוב של התמרה חושית עם 200 IU/mL il-2 ו- 4 ננוגרם למ”ל IL-7. חזור על שלבים 2.6.7 – 2.6.8. להסיר תאים לצנטריפוגה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עבור תאים 4 h. transduced לאסוף כמו צעדים 2.7.2-2.7.3. לספור תאים, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות, להשעות מחדש ב- TCM מלאה על צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים למ”ל עם 100 U/mL היל-2 ו- 2ng/mL mIL-7. להעביר בקבוקון תרבות בגודל כראוי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הוסף מדיה TCM טריים המכילים 100U/mL היל-2 ו- 2ng/mL mIL-7 כל יומיים, שמירה על צפיפות התאים של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל….הערה: Splenocytes שנקטפו מכילים מגוון רחב של סוגי תאים. בתנאים אלה התרבות תאי T שאינם מתים ככה במשך 2-3 ימים. לאחר ~ 4 ימים בתרבות תא, המספר של תא T שווה בדרך כלל המספר הכולל של splenocytes שנקטפו ביום 0. 3. מדידה של יעילות התמרה חושית על יום 4 פוסט התמרה חושית, לאסוף דגימת תאי T transduced או אי-transduced (כ 3 x 105 תאים). Centrifuge התליה תא ב 500 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted פעם אחת עם PBS, צנטריפוגה שוב. למחוק את תגובת שיקוע והוסף μL 100 ל- PBS המכיל amine מתאימים תגובתי צבע (למשל, חי/מת הכתם, דילול 1 ל-100) לכל טוב. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף פעמיים עם PBS צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דק. להשליך תגובת שיקוע, דגירה עם μL 50 FACS מאגר המכיל אנטי עכבר נוגדנים CD16/CD32 עבור קולטן Fc חסימת (דילול 1 ל-100). תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. להוסיף ישירות μL 50 של נוגדן מכתים מיקס מאסטר המכילים אנטי עכבר CD4-BV786 ו CD8-BV711 נוגדנים (סופי ריכוז 1 μL הבאר במאגר FACS). תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C בחושך. חזור על השלב שטיפת 3.3. מחדש להשעות את התאים במאגר PFA 1% ולשמור בחושך ב 4 ° C עד ניתוח לפי cytometry זרימה. לנתח תאים עם המקבילה cytometer מתאים באמצעות קרינה פלואורסצנטית BV711, BV785 ו- mCherry כמו סמנים של CD4 ו CD8 משנה וביטוי המכונית בהתאמה gating כמו (איור 2). 4. במבחנה אימות של המכונית T cell פעילות זרעי syngeneic היעד CD19+ תאים סרטניים עם או בלי ביטוי לוציפראז צפיפות של עונה 1 פרק 10 תאים4 ב 100 μL TCM/טוב ב 96-ובכן U-תחתון צלחת תרביות רקמה. להוסיף 1 x 104 CD19 המכונית T תאים/טוב נפח של 100 μL טוב כדי להשיג אפקטור של היעד (E:T) יחס של 1:1.הערה: E:T יחסי גלובאלים לכל מכונית לבנות והקצו שורת התאים. שימוש T תאים לבד, תאים סרטניים לבד כפקדי שלילי ותאי T מגורה על ידי פעילים-phorbol-אצטט (PMA) (50 ng/mL), ionomycin (1 μg/mL) כפקד חיובי לשחרור אינטרפרון גמא (IFNγ). תרבות משותפת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ב 16-24 שעות. בעקבות תרבות משותפת, centrifuge הלוחות ב 500 g x עבור 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע לצורך ניתוח IFNγ ואליסה IL – 12 p 70 נוסף.הערה: זה ניתן לאחסן ב- 80 ° c מחדש להשעות תא כדורי ב- 100 μL ל- PBS המכילים luciferin (הריכוז הסופי של 1.5 mg/mL). דגירה הלוחות 10 דקות ב 37 º C. ואז למדוד את לומינסנציה מכל קידוח עם luminometer מתאים.הערה: פעמים חשיפה חייב להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים וצפיפות. התוצאות נציג מוצגים באיור 3 א. לשעבר-ויוו cytotoxicity של תאי T רכב יכול להיות שונה כדי luciferin אקספרס על-ידי תרבות משותפת עם שורות תאים המבטאים אנטיגן מטרה. כמו תאי T המכונית להרוג תאים היעד, luciferin הוא שוחרר, ולכן צמצום luminometry אות הוא מתואם עם תא להרוג. תאים transduced-שאינו יכול לעיתים קרובות יש השפעה על יכולת הקיום של תא המטרה, במיוחד על פני תקופות זמן הדגירה. מודדים את ריכוז מאתר IFNγ ו- IL – 12p 70 ב- תגובת שיקוע על פי פרוטוקולים אליסה של היצרן. התוצאות נציג מוצגים (איור 3b ו- 3 c). לשעבר-vivo הפעלה של המכונית T תאים על-ידי תרבות משותפת עם שורות תאים המבטאים אנטיגן מטרה ניתן לבדיקה באמצעות ניתוח תוכן supernatant באמצעות אליסה. היחס של תא T המכונית לתאי המטרה, אורך תקופת תרבות משותפת חייב להיות אופטימיזציה עבור בניית כל רכב, קו תא היעד או analyte. ובחום וטיפול ionomycin יכול לשמש כפקד חיובי כדי לוודא איכות תאי T והיכולת שלהם להגיב. 5. להעריך את פעילות אנטי סרטניים בעכברים פרוטוקול 1 לבצע 100 מ ג/ק ג תוך ורידי (IV) מסירת ציקלופוספמיד לתוך עכברים BALB/c 6 עד 8 שבועות. דבר זה מאפשר גידול engraftment ללא lymphodepletion משמעותי17 (איור 4).הערה: הקמת A20 לימפומה יכול לקחת מעל חודשיים עם קצב שיוצרת לקחת. זה ניתן לשפר על ידי שימוש ציקלופוספמיד עד יום אחד לפני המסירה של תאים לימפומה. על מנת ללמוד lymphoreplete עכברים, זיהינו מנה של ציקלופוספאמיד זה יכול להגביר את היעילות של לימפומה מבלי לגרום lymphodepletion. למחרת, להזריק 100 µL של 5 x 105 syngeneic A20 B-cell לימפומה תאים שונה כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי, לוציפראז ו ירוק (GFP) לתוך עכברים בזריקה תוך ורידי (IV). לאפשר העכברים לפתח לימפומה מערכתית עבור ~ 17 ימים. לאשר הנוכחות של לימפומה מערכתית על ידי הזרקה בקרום הבטן (IP) של 100 μL של 30 מ”ג/מ”ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. השתמש במפרידי כדי להימנע אות והתאמת לתוך עכברים סמוכים. לחשוף עכברים עבור 1 דקות בצד הגחוני עם אזור בגודל קבוע של עניין. מציגים יחידות קלות יחסית (RLU) פוטונים לשניה (p/s). הגדרות חייב להיות מותאם עבור כל דגם הגידול; השתמש של חשיפה יכולה לאסוף גילוי מוקדם של גידולים, אך לא תוביל רוויה כמו גידולים להגיע נקודות הקצה. RLU סה כ רשומות עבור כל עכבר עם קבוע בגודל אזור בעל עניין. (איור 5 א ו- b). תזריק מנה אחת של עונה 1 פרק 106 תאי T המכונית בזריקה הרביעי לתוך עכברים lymphoreplete הנושאת הוקמה לימפומה.הערה: (חשוב) מינון רמות יש ליצור עבור כל מכונית לבנות בהתאם ללוח זמנים הסלמה מנה על מנת להבטיח כי כל רעילות אפשריות הנובעות בתאי T המכונית מאופיינים, ניתן לטפל. למרות אנטי-העכבר CD19 המכונית T תאים אינם מציגים רעילות, המכונית T תאים יכולים להצמיח רעילות בלתי צפויות. איפה המכונית בונה מרובים, התמרה חושית היעילות אינם זהים, המספר הכולל של תאי T מנוהל יש לשמור שווה על ידי התוספת של תאי T-transduced לתוך התא ההכנות. לפקח על התקדמות המחלה שבועי דרך IP הזרקה של 100 μL של 30 מ”ג/מ”ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת (איור 5 c) הדמיה. מקרוב לפקח על עכברים סימנים של רעילות, המתת חסד כל העכברים שמראים סימנים מוקדמים של שיתוק גפיים הינד (HLP) או נטל הגידול פתולוגיים לפני כל הסבל יכול להיווצר.הערה: רעילות מ A20 לימפומה יכולה לכלול שיתוק גפיים הינד דרך הגידול הפלישה של קרומי המוח. בדוק בקביעות סימנים מוקדמים של דהירה מסולף. באופן דומה, גידולים גדולים IP יכול להיווצר אשר עלול לגרום אי נוחות שמוצג על ידי התנהגות שונה. לפקח על הישרדות של עכברים 60-100 ימים (איור 5 d). לבצע המתת חסד על ידי שיטת תזמון-1 בתום הניסוי. פרוטוקול 2 לספק ציקלופוספמיד 200 מ”ג/ק”ג ל- 6 – 8, בן שבועיים BALB/c לעכברים בזריקה הזנב וריד ב 100 μL ל- PBS לכל העכבר. למחרת, להזריק 5 x 105 syngeneic A20 B-cell לימפומה תאים המבטאים לוציפראז ו- GFP 100 μL PBS דרך הזנב וריד הזרקת. לאפשר העכברים לפתח לימפומה מערכתית עבור ~ 7-14 ימים לאשר לימפומה מערכתית על ידי הזרקת ה-IP של μL 100 של 30 מ”ג/מ”ל luciferin והדמיה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. בצע 5 Gy גופית (TBI) ב- Gy 0.02 נקודות/דקה עבור lymphodepletion.הערה: בחולים שעברו טיפולי רכב T-cell עוברים מגוון של משטרי כדי להשיג lymphodepletion לפני הממשל של תאי T רכב אשר מגביר באופן משמעותי את engraftment של adoptively הועבר הרכב T תאים. זה ניתן לשכפל אותו אצל עכברים עם גופית (TBI) (איור 6). ביום הבא, להזריק עונה 1 פרק 106 תאי T רכב ב- 100 μL של גידולים PBS דרך הזנב וריד הזרקה לתוך עכברים הנושאת הוקמה. לאסוף דם דגימות דרך הזנב וריד דימומים לאחר 7 ימים. להוסיף מאגר פירוק תא אדום כדי שכל דוגמית דם ולאחר מכן להכין עבור cytometry זרימה כמתואר בסעיף 3. לנתח את המכונית T התמדה תא במחזור מאת cytometry זרימה (איור 2).הערה: תוספת של חרוזים הספירה מייד לפני cytometry מאפשר קביעת המספר של הרכב T תאים למיליליטר דם. לפקח על התקדמות המחלה כפי שתואר בשלבים 5.1.5 – 5.1.8 (איור 7).