Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto l’egida dell’atto di animali (procedure scientifiche) 1986 e sotto UK Coordinating Committee per orientamenti di ricerca sul cancro. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti presso l’Istituto CRUK-Manchester e approvati dal locale benessere animale ed etica Esaminiamo corpo (CRUK-MI AWERB). 1. preparati Maxiprep pMP71 retroviral costruire plasmide e pCL-Eco retrovirus imballaggio plasmidi18.Nota: pMP71 codifica mCherry e l’auto separati da una sequenza di FMDV2A. Questo è intercambiabile con altri retrovirali. pCL-Eco codifica gag, pol e le proteine dell’involucro ecotropic. Preparare mezzo completa T cellulare (TCM) per la coltura di cellule di topo T usando medium RPMI 1640, 10% FCS, 1% 100 x penicillina-streptomicina-glutamina (PSG).Nota: La soluzione contiene 100 UI/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 2 mM di L-Glutammina), 50 μM β-mercaptoetanolo e 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES). Coltura di cellule A20 in RPMI 1640, 10% FCS e 0,05 mM β-mercaptoetanolo a 37 ° C, 5% CO2. Coltura le cellule Platinum-E (Plat-E) in completa di Dulbecco modificate eagle medium (DMEM) (DMEM con 10% siero fetale del vitello (FCS), 2 mM L-Glutammina, 1 con puromicina μg/mL e 10 μg/mL Consciousness) a 37 ° C, 5% CO2.Nota: Plat-E cellule sono derivate dalle cellule 293T ed esprimono proteine retrovirali dell’involucro gag, pol ed ecotropic. Preparare la transfezione soluzioni multimediali 1 e 2 immediatamente prima della transfezione. Preparare soluzione 1 (pH 7,9) per contenere DMEM + 10% FCS + 25mm HEPES, soluzione 2 (pH 7.1) per contenere DMEM + 25mm HEPES. Preparare 10 μg/mL di soluzione di frammento ricombinante fibronectina umana diluendo con soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS) e conservare a-20 ° C fino all’utilizzo. Sterile filtrare tutti i media 0,2 μm filtri prima dell’uso (escluso frammento di fibronectina umana ricombinante). 2. retrovirali trasduzione delle cellule T Giorno 1: Preparazione per la transfezione Seme: 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) cellule in piastre di coltura di tessuto2 di 15 cm in 18 mL di DMEM completo e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2. Giorno 2: Transfezione della linea cellulare di Plat-E imballaggio retrovirali Preparare 20,4 μg di pcl-Eco packaging vettoriale DNA, 39,6 μg di DNA del plasmide codifica retrovirali auto costrutto e 150 μL di 1m CaCl2 a volume finale di 3 mL di soluzione di transfezione 2 per ogni piatto2 15 cm per essere transfected. Vortexare per 10 s e riposo per 5 min Rimuovere DMEM media dai piatti 15 cm2 e sostituire con 12 mL di soluzione di transfezione 1.Attenzione Quando si cambia il supporto, possono asciugare i piatti2 15 cm al centro. Ciò può causare notevole morte delle cellule transfettate Plat-E. Lavora velocemente e rimuovere i supporti da solo 1-2 piastre per volta. Aggiungere 3 mL di soluzione di transfezione 2 contenente DNA e CaCl2 per ogni piatto di2 cm 15 drop-wise, uniformemente attraverso ogni piatto. Piastre di roccia delicatamente con un movimento di lato a lato per 10 s. Incubare a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte. Giorno 3: Preparazione dei virus contenenti surnatante per trasduzione Sostituisci i media delle cellule transfettate piastra-E con 18 mL completare TCM e tornare in incubatrice.Attenzione Quando cambiare i piatti di media 15 cm2 può asciugare al centro. Ciò può causare notevole morte delle cellule transfettate Plat-E. Lavora velocemente e rimuovere i supporti da solo 1-2 piastre per volta. Giorno 3: Isolamento e in vitro l’attivazione delle cellule T spleniche del topo Rimuovere le milze di topi BALB/c 6-8-week-old come precedentemente descritti da Parkinson et al. 19 e immergerli in sterili, ghiacciata, PBS in una provetta conica da 50 mL. Utilizzare una pinzetta per trasferire una milza in una microcentrifuga da 1,5 mL e omogeneizzare con un pestello con forza minima. Utilizzare una pipetta 1000 μL e ~ 800 μL PBS di trasferire omogeneato per un colino di cella di 100 μm poro apposto su un tubo da 50 mL contenente 5 mL di PBS per raggiungere una sospensione unicellulare. Ripetere il passaggio 2.4.2 per milze aggiuntive. Non superare 3 milze per tubo.Attenzione Splenocytes passato attraverso filtro può formare grumi se lasciato in piedi. Se l’elaborazione di diversi milze per evitare cella agglutinamento, manualmente di turbinio tubi in modo intermittente. Rimanenti frammenti sul filtro delle cellule può essere ulteriormente purè usando uno stantuffo da una siringa da 5 mL utilizzando una forza minima. Superiore a 20 mL con PBS. Strato la sospensione cellulare 20ml delicatamente sul 20ml di media gradiente di densità (Tabella materiali) in una provetta da 50 mL. Centrifugare la sospensione risultante sovrapposta a 800 x g per 20 min con nessun freno azionato. Raccogliere le cellule a livello di interfaccia, utilizzando una pipetta Pasteur sterile e trasferirlo in una provetta 50 mL. Superiore a 50 mL con PBS e centrifuga a 800 x g per 10 min a lavare. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in MTC completa. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro. Coltura di cellule ad una densità di 5 x 106 cellule/mL in MTC completa con 30 ng/mL di un anticorpo anti-CD3ε (Clone 145-2 C 11), 30 ng/mL di un anticorpo anti-CD28 (Clone 37.51), 100 U/mL ricombinante umano il-2 e ricombinante di 2 ng/mL IL-7 murino. Utilizzare un matraccio di cultura del tessuto dimensioni appropriate per il volume di cellule raccolte.Nota: Cellule presentanti l’antigene–sono necessari per l’attivazione delle cellule T dagli anticorpi CD3 e CD28, se lavora con le cellule di T purificate è necessario cappotto piastre con anticorpi o utilizzano biglie magnetiche (Tabella materiali) Incubare splenocytes del topo a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte. Giorno 3: Preparazione delle piastre per la trasduzione Cappotto non-tessuto-cultura 6-pozzetti con 2 mL di 10 μg/mL di fibronectina umana ricombinante del frammento e incubare per una notte a 4 ° C. Giorno 4: Trasduzione di cellule di T Trasferimento frammento di fibronectina umana ricombinante da piastre di coltura del tessuto freschi 6-pozzetti. Incubare queste piastre durante la notte a 4 ° C per 2 ° turno di trasduzione. Aggiungere 2 mL di TCM in ciascun pozzetto di tavole originali di rivestite con frammento di fibronectina umana ricombinante e lasciare per 30 min a temperatura ambiente per bloccare il legame non specifico. Raccogliere il supernatante contenente retrovirus da cellule trasfettate Plat-E in piastre di coltura del tessuto di 15cm e Sostituisci con 18 mL di TCM completa.Attenzione Lavorare rapidamente per evitare la disidratazione delle cellule Plat-E.Nota: Successo della transfezione può essere controllato in questa fase mediante microscopia a fluorescenza, se utilizzando un gene marcatore fluorescente come mCherry (Figura 1). Filtrare il surnatante contenente retrovirus attraverso 0,45 μm filtro per rimuovere i detriti cellulari. Rimuovere TCM dalle piastre 6 pozzetti rivestite con frammento di fibronectina umana ricombinante e aggiungere 2,5 mL di surnatante filtrato contenenti retrovirus o ad ogni pozzetto (uso completa TCM per la transfezione finta). Etichettare ogni bene per quanto riguarda l’aggiunta di retrovirus o finto media. Centrifugare le piastre a 1200 x g per 30 min a temperatura ambiente. Mentre girano piatti, raccogliere le cellule di T attivate e contare utilizzando un emocitometro. Trasduzione avviene con 5 x 106 attivato splenocytes in un totale di 5 mL/pozzetto. A pellet il numero richiesto di splenocytes per derisione/trasduzione in provette separate mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min. Risospendere splenocytes ad una densità di 5 x 106 cellule per 2,5 mL di surnatante filtrato contenenti retrovirus dal passaggio 2.6.4 o TCM come controllo negativo. Aggiungere ricombinante umano il-2 (hIL-2) e mouse ricombinante IL-7 (mIL-7) a una concentrazione finale di 200 IU/mL e 4 ng/mL rispettivamente. Raccogliere le piastre da 6 pozzetti dalla centrifuga al completamento del passaggio 2.6.5 e aggiungere 2,5 mL/pozzetto risospeso splenocytes in appositi pozzetti per rendere un volume finale di 5 mL/bene e una concentrazione finale di 100 U/mL hIL-2 e 2 ng/mL mIL-7. Centrifugare le piastre a 1200 x g per 90 min a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione, incubare le piastre a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte. Giorno 5: Round 2 della trasduzione Raccogliere il frammento di fibronectina umana ricombinante dalle piastre come questo può essere riutilizzato. Ripetere i passaggi 2.6.2 – 2.6.5. Mentre girano piatti, raccogliere le cellule dal 1st tondo di trasduzione utilizzando una pipetta Pasteur. Sciacquare ogni pozzetto con 2 mL di PBS, turbinio e raccogliere tutte le cellule rimanenti in ciascun pozzetto.Nota: Pipettare su e giù per risospendere le cellule sedimentate. Raccogliere ogni gruppo di controllo/trasduzione in provette separate. Provette per centrifuga a 500 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 2,5 mL per pozzetto di trasduzione con 200 IU/mL IL-2 e 4 ng/mL IL-7. Ripetere i passaggi 2.6.7 – 2.6.8. Rimuovere le cellule dalla centrifuga e incubare a 37 ° C, 5% CO2 per celle di 4 h. raccogliere trasformata come passi 2.7.2-2.7.3. Contare le celle, centrifugare a 500 x g per 5 min e risospendere in TCM completa ad una densità di 1 x 106 cellule/mL con 100 U/mL hIL-2 e 2ng/mL mIL-7. Trasferire in un pallone di cultura opportunamente dimensionati e incubare a 37 ° C, 5% CO2. Aggiungere file multimediali TCM fresco contenente 100U/mL hIL-2 e 2ng/mL mIL-7 ogni 2 giorni, mantenere una densità cellulare di 1 x 106 cellule/mL.Nota: Splenocytes raccolte contengono una varietà di tipi cellulari. In queste condizioni di coltura, le cellule T non muoiono nel corso di 2-3 giorni. Dopo ~ 4 giorni nella coltura cellulare, il numero di cellule T è in genere equivalente al numero totale degli splenocytes raccolte il giorno 0. 3. misurazione della efficienza di trasduzione Sulla trasduzione di post del giorno 4, raccogliere un campione di cellule T trasdotte o non trasdotte (circa 3 x 105 cellule). Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min, eliminare il supernatante, lavare le cellule pellettate una volta con PBS e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante e aggiungere 100 μL di PBS contenente un colorante reattivo di ammina adatto (per esempio, live/dead macchia, diluizione 1 a 100) per pozzetto. Incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio. Lavare due volte con PBS e centrifugare a 500 g per 5 min, scartare il surnatante e incubare con 50 μL di tampone di FACS contenente anticorpi anti-topo CD16/CD32 recettori Fc blocco (diluizione 1 a 100). Incubare per 10 min a 4 ° C. Direttamente aggiungere 50 µ l di anticorpo che macchia mix master contenente anti-topo BV786 CD4 e CD8-BV711 anticorpi (concentrazione finale di 1 μL/pozzetto nel buffer di FACS). Incubare per 30 min a 4 ° C nel buio. Ripetere il passaggio di lavaggio 3.3. Risospendere le cellule in buffer di PFA 1% e mantenere al buio a 4 ° C fino all’analisi di citometria a flusso. Analizzare le cellule con citometro adatto equivalente utilizzando BV711, BV785 e mCherry fluorescenza come marcatori di sottoinsieme CD4 e CD8 e di auto espressione rispettivamente gating come in (Figura 2). 4. in vitro convalida di auto T cell attività Seme syngeneic destinazione CD19+ le cellule del tumore con o senza espressione di luciferase ad una densità di 1 x 104 cellule in 100 μL TCM/pozzetto in un fondo U 96 pozzetti piastra di coltura del tessuto. Aggiungere 1 x 104 CD19 auto T cellule/pozzetto in un volume di 100 μL/pozzetto per raggiungere un realizzatore al rapporto di 1:1 di destinazione (t).Nota: E:T rapporti dovrebbero essere stabiliti per ogni auto costruire e linea cellulare di destinazione. Solo uso T cellule e le cellule del tumore da solo come controllo negativo e cellule T stimolate dall’acetato di miristato di phorbol (PMA) (50 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) come controllo positivo per il rilascio di interferone gamma (IFNγ). Cellule di co-coltura a 37 ° C, 5% CO2 per 16-24 h. A seguito di co-coltura, centrifugare le piastre a 500 x g per 5 min e raccogliere il surnatante per ulteriori analisi IFNγ e IL – 12p70 ELISA.Nota: Questo può essere conservato a-80 ° C. Risospendere il pellet di cellule in 100 μL di PBS contenente luciferina (concentrazione finale di 1,5 mg/mL). Incubare le piastre per 10 min a 37 ° C. Quindi misurare la luminescenza da ogni pozzetto con un luminometro adatto.Nota: Tempi di esposizione devono essere ottimizzati per densità e linee cellulari. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3a. Ex-vivo di citotossicità delle cellule di T auto modificabile a luciferina espressa dalla co-cultura con linee cellulari che esprimono antigene bersaglio. Come le cellule di T auto uccidono le cellule bersaglio, luciferina viene rilasciato, quindi una riduzione del segnale di parametri è correlata con l’uccisione delle cellule. Cellule trasdotte non possono spesso avere un effetto sulla vitalità cellulare di destinazione, soprattutto per periodi di incubazione lunga. Misurare la concentrazione di murino IFNγ e IL – 12p70 nel surnatante secondo protocolli di ELISA del produttore. Risultati rappresentativi sono mostrati in (Figura 3b e 3C). Ex vivo l’attivazione delle cellule di T auto da co-coltura con linee cellulari che esprimono l’antigene bersaglio può essere analizzato analizzando surnatante contenuto usando ELISA. Il rapporto delle cellule di T auto alle cellule bersaglio e la lunghezza del periodo di co-coltura deve essere ottimizzati per ogni costrutto auto, riga della cella di destinazione e dell’analita. Trattamento di PMA e ionomicina può essere utilizzato come controllo positivo per confermare la qualità delle cellule T e la loro capacità di rispondere. 5. valutare l’attività anti-cancro in topi Protocollo n. 1 Effettuare 100 mg/kg per via endovenosa (IV) consegna di ciclofosfamide in topi BALB/c 6 a 8 settimane. Questo consente di attecchimento del tumore senza significativi lymphodepletion17 (Figura 4).Nota: Che istituisce A20 linfoma può prendere più di 2 mesi con un tasso di prendere non ottimali. Questo può essere migliorato tramite l’uso di ciclofosfamide 1 giorno prima della consegna delle cellule di linfoma. Al fine di studiare lymphoreplete topi, abbiamo identificato una dose di ciclofosfamide che potrebbe aumentare l’efficienza di linfoma senza causare lymphodepletion. Il giorno successivo, iniettare 100 µ l di 5 x 105 syngeneic A20 B-cellula linfoma a cellule modificate per esprimere la proteina fluorescente luciferasi e verde (GFP) in topi per iniezione endovenosa (IV). Consentire i topi di sviluppare linfoma sistematico per ~ 17 giorni. Confermare la presenza di linfoma sistematico tramite l’iniezione intraperitoneale (IP) di 100 μL di luciferina di 30 mg/mL e imaging utilizzando un bioluminescenza in vivo imaging system. Utilizzare i separatori per evitare la ricaduta di segnale in topi adiacenti. Esporre i topi per 1 min sul lato ventrale con una regione di dimensione costante di interesse. Visualizzare unità di luce relativa (RLU) come fotoni al secondo (p/s). Le impostazioni devono essere ottimizzate per ogni modello di tumore; utilizzare un’esposizione che può ritirare la diagnosi precoce dei tumori, ma non porta a saturazione come tumori raggiungono gli endpoint. RLU record totali per ogni mouse con una costante di dimensioni area di interesse. (Figura 5a e b). Iniettare un linfoma di singola dose di 1 x 106 cellule T auto tramite iniezione IV lymphoreplete topi cuscinetto stabilito.Nota: (importante) Livelli di dosaggio deve essere stabilito per ogni auto costruire utilizzando un programma di escalation della dose per assicurare che qualsiasi possibile tossicità derivanti da cellule T auto sono caratterizzate e possono essere affrontate. Anche se cellule di anti-topo CD19 auto T non vengono visualizzate le tossicità, le cellule di T auto possono dar luogo a tossicità inattesa. Dove più efficienza di trasduzione e costrutti di auto non è identico, il numero totale delle cellule di T amministrato deve rimanere uguale con l’aggiunta di cellule di T non trasdotte in preparazioni di cellule. Monitorare la progressione della malattia settimanale attraverso iniezione del IP di 100 μL di luciferina di 30 mg/mL e imaging utilizzando un bioluminescenza in vivo imaging system (Figura 5C). Attento monitoraggio topi per i segni di tossicità ed eutanasia qualsiasi topi che mostrano segni precoci di paralisi dell’arto (HLP) o carico patologico del tumore prima di qualsiasi sofferenza può sorgere.Nota: Tossicità da A20 linfoma possono includere paralisi dell’arto posteriore attraverso l’invasione del tumore delle meningi. Controllare regolarmente per i primi segni di andatura alterata. Allo stesso modo, i grandi tumori IP possono sorgere che può portare a disagio mostrato dal comportamento alterato. Monitorare la sopravvivenza dei topi per 60-100 giorni (Figura 5d). Eseguire l’eutanasia di un metodo di pianificazione-1 al momento della conclusione dell’esperimento. Protocollo n. 2 Consegnare la ciclofosfamide 200 mg/kg a 6-8 – settimana-vecchi topi BALB/c tramite l’iniezione della vena coda in 100 μL di PBS per topo. Il giorno seguente, iniettare 5 x 105 syngeneic A20 B-cellula cellule di linfoma esprimendo la luciferasi e GFP in 100 μL PBS tramite vena iniezione coda. Consentire i topi sviluppare i linfomi sistematici per ~ 7-14 giorni Confermare linfoma sistematico tramite l’iniezione di 100 μL di luciferina di 30 mg/mL e imaging utilizzando un bioluminescenza in vivo imaging sistema IP. Eseguire 5 Gy-irradiazione corporea totale (TBI) a 0.02 Gy/min per lymphodepletion.Nota: Pazienti sottoposti a trattamenti con le auto T-cellule subiscono una gamma di regimi di raggiungere lymphodepletion prima l’amministrazione delle cellule di T di auto che aumenta significativamente l’attecchimento di passivamente trasferiti le cellule di T di auto. Questo può essere replicato in topi con irradiazione corporea totale (TBI) (Figura 6). Il giorno successivo, iniettare 1 x 106 cellule T auto in 100 μL di PBS tramite coda vena iniezione nei topi cuscinetto stabilito tumori. Raccogliere sangue campioni via coda vena sanguina dopo 7 giorni. Aggiungere tampone di lisi delle cellule rosse per ogni campione di sangue, quindi preparare per citometria a flusso come descritto nella sezione 3. Analizzare la persistenza di cella auto T nella circolazione da citometria a flusso (Figura 2).Nota: Aggiunta di perline conteggio immediatamente prima della citometria a permette di determinare il numero di auto T cellule per millilitro di sangue. Monitorare il progresso di malattia come descritto ai punti 5.1.5 – 5.1.8 (Figura 7).