نموذج ماوس سينجينيك اللمفاوية ب-خلية للتقييم قبل الإكلينيكية لخلايا تي سيارة CD19
Summary
وهنا، يقدم بروتوكول لإنتاج واختبار قبل الإكلينيكية مورين CD19 سيارة تي الخلايا عن طريق توصيل الفيروسات التراجعية واستخدامها كعلاج ضد المنشأة سينجينيك A20 ب-خلية سرطان الغدد الليمفاوية في الفئران بالب/c مع أو بدون ليمفوديبليتينج تكييف مسبقاً.
Abstract
وقد أدى نجاح مذهل السريرية CD19 مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) تي خلية العلاج بالموافقة على الجيل الثاني اثنين مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) لسرطان الدم الليمفاوي الحاد (جميع) أندنون-هودجكين الأورام اللمفاوية (NHL). تركيز الميدان الآن على محاكاة هذه النجاحات في سائر الأورام الخبيثة الدموية حيث لوحظت معدلات الاستجابة الكاملة أقل تأثيراً. كذلك هندسة الخلايا T السيارة أو الإدارة المشتركة لطرائق العلاج الأخرى قد بنجاح إلى تذليل العقبات التي تعترض العلاج الناجح في إعدادات أخرى للسرطان.
ولذلك فإننا نقدم نموذجا فيه آخرون يمكن إجراء التجارب قبل الإكلينيكية للخلايا T السيارة CD19. النتائج في هذا النموذج سرطان الغدد الليمفاوية الخلية ب اختبارها جيدا من المحتمل أن تكون غنية بالمعلومات سيارة تي خلية العلاج بصفة عامة.
يسمح هذا البروتوكول إنتاج استنساخه من الماوس الخلايا T السيارة عن طريق فوسفات الكالسيوم تعداء الخلايا منتج ه بلات مع MP71 بنيات للفيروسات الرجعية والإيكولوجية pCL التغليف بلازميد تليها مجموعة من جزيئات الفيروس يفرز و توصيل باستخدام جزء فيبرونيكتين البشري الماشوب والطرد المركزي. التحقق توصيل النسخ العكسي، وتأكيدا لقدرة خلايا “تي سيارة” لقتل الهدف لمفوما الخلايا السابقين فيفو، من خلال استخدام التدفق الخلوي ولومينوميتري والمرتبط بالانزيم المرتبط الاعتداء (ELISA)، وهو كما هو موضح.
يرد الفئران سينجينيك ليمفوديبليتيد، إذ تضع المنهجية المتبعة، وسرطان الغدد الليمفاوية والبروتوكولات لاختبار T سيارات الخلايا في الجسم الحي في ليمفوريبليتي. ويرصد في فيفو الإضاءة الحيوية والمرض تطور نشاط مضاد للسرطان. نعرض النتائج النموذجية للقضاء على المنشأة ب-الخلية اللمفاوية عند استخدامش 1 أو 2nd جيل السيارات في تركيبة مع تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج وأقلية من الفئران تحقيق المغفرة طويلة الأجل عند استخدام “السيارة تي” خلايا معربا عن إيل-12 في الفئران ليمفوريبليتي.
يمكن استخدامها لتقييم الخلايا T سيارات CD19 مع التعديل إضافية مختلفة، ومجموعات من خلايا “تي السيارة” وغيرها من العوامل العلاجية هذه البروتوكولات أو تكييفها لاستخدام الخلايا T سيارات ضد المستضدات المستهدفة المختلفة.
Introduction
مستضد تشيميريك مستقبلات (السيارات) تي خلية العلاج قد أظهرت نجاح مذهل السريرية في علاج CD19+ الأورام الخبيثة التي تؤدي إلى الموافقة على تيساجينليكليوسيل لسرطان الدم الليمفاوي الحاد انتكست1 وأكسيكابتاجيني سيلوليوسيل التدريجي كبيرة ب-الخلية اللمفاوية غير هودجكن2 في عام 2017.
تزداد أهمية التفاعلات بين السرطان والجهاز المناعي في المرض والآليات العلاجية المعترف بها على نحو متزايد3،4،5. على سبيل المثال، أنها موثقة جيدا أن ورم المكروية (TME) يفيض بالعوامل التي يمكن أن تقمع وظائف المستجيب للخلايا المناعية6،،من78. وبدلاً من ذلك يمكن فتيلة من الخلايا المناعية الذاتية ونشر حانمه مفتاح في استئصال الورم ومقاومة طويلة الأمد للورم التحدي9،10. لا يمكن تقييم كل من هذه الظواهر في نماذج إكسينوجينيك التي تفتقر إلى نظام المناعة. وبالمثل، نظم استخدام البروتينات المعدلة وراثيا لا تعكس بدقة التحدي المتمثل في كسر التسامح المناعية التي يتطلبها حانمه نشر11،12. ذا، نموذج سينجينيك مع نظام المناعة تعمل بكامل طاقتها القصوى لنمذجة هذه الجوانب الهامة من المداواة المناعية وتطور مرض السرطان.
تحذير هام من السيارة تي خلية العلاج أن تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج المطلوبة للنجاح العلاجي13،14. ويتحقق ذلك عادة في المرضى بإدارة العلاج الكيميائي قبل التسريب من15،خلايا “تي السيارة”16. كطريقة قياسية، بغية تقليد ليمفوديبليشن المستخدمة في إعداد المرضى، ونحن إدارة 5 تشعيع الجسم الكلي غراي (تبي) لتحقيق ليمفوديبليشن قبل إقامة خلايا “تي سيارة” العلاجية للفئران إذ تضع منهجية A20 ب-الخلية اللمفاوية.
بينما تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج ليس مشكلة بالنسبة الغالبية العظمى من المرضى، السمية التي تأتي مع وكلاء العلاج الكيميائي يعني أن مرضى حالة انخفاض الأداء غير مؤهلة للعلاج بسيارة تي خلية. لإنشاء نظام اختبار الذي يمثل المرضى غير مؤهلة ليمفوديبليشن، قمنا بإنشاء نموذج ماوس سينجينيك ليمفوريبليتي التي نحن نموذج سيارة تي خلية العلاج من سرطان الغدد اللمفاوية. في هذا النموذج، واظهرنا أن إفراز إيل-12 من داخل خلايا “تي السيارات” يمكن أن يؤدي إلى القضاء على الأورام اللمفاوية المنشأة مع معدل نجاح ~ 25%17. وعلاوة على ذلك، نحن وأظهرت أن الخلايا المناعية الذاتية شاركوا في القضاء على السرطان.
هنا نحن تصف بالتفصيل البروتوكول لإنتاج خلايا “تي سيارة” الماوس، إنشاء سرطان الغدد الليمفاوية في الفئران سينجينيك، والعلاج من سرطان الغدد الليمفاوية مع خلايا “تي سيارة” مع أو بدون استخدام تكييف ما قبل ليمفوديبليتينج. يمكن استخدام هذا للدراسات تركيبة الخلايا T السيارة مع عوامل أخرى، اختبار خلايا “تي سيارة” مع أخرى المتسلسلات أو لاستخدام استراتيجيات العلاج أو العلاج المناعي التبني خلية أخرى ضد سرطان الغدد الليمفاوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج الماوس سينجينيك السماح باختبار تطور المرض والعلاج مع الحفاظ على نظام المناعة سليمة. وهذا بالغ الأهمية عندما يتعلق الأمر بالعلاجات التي تتفاعل مع النظام المناعي، وخاصة لعملاء إيمونوثيرابيوتيك.
البروتوكول هو موضح هنا اتجاهين العمل الحاسم، وأول واحد هو تعديل وراثيا الماوس تي خلية للتعبير عن السيارات. وهذا يتطلب 7 أيام من بدء للتحقق من توصيل. المتزامن مع إنتاج خلايا “تي السيارة” إنشاء لمفوما النظمية في الفئران. ينبغي أن تفشل في إنتاج الخلايا T السيارة، أو يجري نوعية كافية، ليست هناك عادة ما يكفي من الوقت لإنتاج الخلايا استبدال قبل الفئران تستسلم للأورام اللمفاوية. ولذلك من الأهمية بمكان أن الباحثين باستخدام هذه النماذج بدقة أداء الورم الجرعات والمرض تطور الدراسات من أجل نجاح وقت إنتاج خلايا “تي سيارة” للإدارة العلاجية.
الأسباب النموذجية لانخفاض كفاءة توصيل تي خلية تتضمن كفاءة الفقراء تعداء الخلايا المنتجة، وعادة بسبب نقاء بلازميد الفقراء أو تحديد غير دقيق لدرجة الحموضة من تعداء وسائل الإعلام. من المستحسن للتحقق من كفاءة إنتاج الخلية تعداء وقبل أن نمضي مع بروتوكول كامل تعداء الفقيرة سوف تحد من كفاءة توصيل تي خلية. يمكن جمعها شظايا فيبرونيكتين البشري الماشوب والمخزنة في-20 درجة مئوية لإعادة استخدامها، ومع ذلك، نتيجة التجميد يذوب متعددة في توصيل انخفاض الكفاءة. المعالجة السريعة للطحال الماوس بعد جمع مهم أيضا للحصول على ارتفاع غلة من خلايا تي قابلة للحياة.
تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول هو موضح هنا تستخدم الخلايا A20 معربا عن لوسيفراس. هذا المفضل لأنه يوفر القدرة على قياس عبء الورم النظامية بتصوير الإضاءة الحيوية. ومع ذلك، حضور المناعي وظيفية، يمكن أن تحرف الردود إلى لوسيفراس النتائج. اختبرناها سابقا ردود فعل المناعة من الباقين على قيد الحياة الفئران إلى علامة المتسلسلات17. فمفتاح لتكرار التجارب الرئيسية استخدام A20 الخلايا الحرة المتسلسلات للتحقق من صحة أن هذه لا تلعب دوراً هاما في القضاء على الورم بالخلايا المناعية.
بينما العوامل السريرية فقط يمكن المستخدمة في فيفو في الفئران التي تفتقر إلى المناعة، استخدام الماوس T سيارات خلايا ضد الخلايا السرطانية الماوس يسمح لنا لتقييم مساهمات المناعي للتقدم العلاجي فعالية أو المرض. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتقييم قبل الإكلينيكية للسيارات تستهدف الأورام اللمفاوية ب-الخلية أو السيارات الأخرى مع تعديلات إضافية مثل إفراز إيل-12 كما هو موضح هنا. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن يمكن تقييم التفاعل بين الخلايا المناعية في نماذج الماوس سينجينيك، أنهم قد لا الخص دقة التفاعل في البشر في فيفو. خاصة ملاحظة أن البشرية والماوس السيارات سوف تختلف في هذا الهيكل الذي قد تكون له عواقب المتلقين للمعلومات؛ الظروف التنشيط وخلية الثقافة المثلى لنمو الخلايا T مختلفة20، توزيع الأنسجة المستهدفة مستضد التعبير قد تختلف بين البشر والفئران وذوي الخبرة السمية قد تكون مختلفة اختلافاً جذريا. ولذلك من الضروري الاستفادة من السابقين فيفو ونماذج إكسينوجينيك للتأكد من صحة النتائج.
وباختصار، الخص ليمفوديبليتيد سينجينيك ونموذج ليمفوريبليتي من سرطان الغدد الليمفاوية المرضى مع أو بدون سابقة الكيماوي/العلاج الإشعاعي. وهذا يوفر نظام نموذج لمحاكاة إعدادات السريرية للسماح بإجراء التجارب على مجموعة من الاستراتيجيات العلاجية التي سوف يكون من المهم مع الموجه القادمة من وكلاء العلاج المناعي جديدة.
مع استخدام تكييف السابقة، تجدر الإشارة إلى أن جميع الفئران واضحة عادة الأورام اللمفاوية. مع أعلى معدلات الاستجابة الكاملة 90% في البشر، وهذا هو الممثل. غير أن التحديات لسيارة CD19 تي خلية العلاج سوف يتوقف على منع الترددات العالية من الانتكاسات ولاحظ أنه غالباً ما CD19. الانتكاسات لا لوحظت في هذا النموذج تصل إلى، وكثيراً ما تتجاوز 100 يوم. يمكن أن تساعد التعديلات لتقليد الانتكاسات في العيادة مع التحديات المستقبلية لسيارات CD19 تي خلية العلاج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر بلودويسي على تمويل هذه البحوث (منحة 13031) وفي “مانشستر كروك” البيولوجي وحدة والتصوير والخلوي والبيولوجيا الجزيئية الأساسية مرافق الموارد لدعم هذا العمل.
Materials
| 0.2 µm syringe filter | Appleton Woods | FC121 | |
| 0.45 µm syringe filter | Appleton Woods | FC122 | |
| 1.5ml pestle and microtube | VWR | 431-0098 | |
| 100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Gibco | 10378016 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350–010 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma- Aldrich | 15205 | |
| Bottle Top Filter (0.2 µm) | Scientific Laboratory Supplies | FIL8192 | |
| Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100759 | 1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7 |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100552 | 1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma- Aldrich | C7902 | |
| Cell counting beads – CountBright absolute counting beads | Molecular Probes | C36950 | |
| Cell Strainer 100μm | VWR | 734-0004 | |
| Cyclophosphamide Monohydrate | Merck | 239785-1GM | |
| Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) – High Glucose | Sigma Aldrich | D6546 | |
| Dynabeads | Gibco | 11131D | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-03 | Sold by Sigma- Aldrich |
| Flow cytometer – LSR Fortessa x20 | BD Biosciences | 658222R1 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Haemacytometer | Appleton Woods | HC001 | |
| HEPES solution | Sigma- Aldrich | H0887 | |
| IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit | Invitrogen | 88-7121-76 | |
| IL2, Proleukin | Novartis | PL 00101/0936 | |
| in vivo bioluminescence imaging system – in vivo xtreme II imaging system | Bruker | T149094 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma- Aldrich | I0634 | |
| Live/dead stain – Zombie Violet Fixable Viability Kit | BioLegend | 423114 | 1 in 100 staining dilution |
| Luminometer – Lumistart Omega | BMG Labtech | 415-301 | |
| Murine IFN-γ ELISA kit | Diaclone | 861.050.010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma- Aldrich | 16005 | |
| pCL-Eco | Novus Biologicals | NBP229540 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma- Aldrich | P8139 | |
| Platinum E cell line | Cell Biolabs | RV-101 | (RRID:CVCL_B488) |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | Clone 37.51 |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3ε | BD Biosciences | 553057 | Clone 145-2C11 |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2 |
| Puromycin Dihydrochloride | Sigma- Aldrich | P8833 | |
| Recombinant human fibronectin fragment – RetroNectin Reagent | TaKaRa | T100B | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free) | BioLegend | 577806 | |
| Red cell lysis buffer | eBioscience | 004-4333-57 | |
| RPMI 1640 Medium | Lonza | BE12-167F | |
| Trypsin – EDTA solution | Sigma- Aldrich | T3924 | |
| XenoLight D-Luciferin | Perkin Elmer | 122799 |
References
- . Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017)
- . Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017)
- Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), 299-308 (2012).
- Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).
- Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).
- Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
- Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
- Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
- Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).
- Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
- Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
- Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
- Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817 (2011).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
- Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
- Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy – Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
- Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).
- Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).
