Un modèle de lymphome de B-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de T de voiture CD19

Toutes les expériences sur des animaux ont été menées sous les auspices de la Loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et sous le Comité de coordination UK pour les orientations de la recherche sur le Cancer. Toutes les études sur des animaux ont été menées à l’Institut CRUK-Manchester et approuvés par le bien-être des animaux locaux et l’évaluation éthique de corps (CRUK-MI AWERB). 1. les préparatifs PMP71 Maxiprep retroviral construire plasmide et pCL-Eco rétrovirus emballage plasmides18.Remarque : pMP71 code mCherry et la voiture, séparés par une séquence de FMDV2A. C’est interchangeable avec les autres constructions rétrovirales. pCL-Eco encode gag, pol et les protéines d’enveloppe ecotropic. Préparer des lymphocytes T complet moyenne (TCM) pour la culture des cellules de souris T utilisant le milieu RPMI 1640, FCS de 10 %, 1 % 100 x pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG).Remarque : La solution contient 100 UI/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2 mM de L-glutamine), 50 μM β-mercaptoéthanol et l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 25 mM 4 (HEPES). Culture de cellules A20 RPMI 1640, 10 % FCS et 0,05 mM β-mercaptoéthanol à 37 ° C, 5 % de CO2. La culture des cellules de platine-E (Plat-E) dans un milieu eagle mis à jour le complet de Dulbecco (DMEM) (DMEM avec du sérum de veau foetal 10 % (FCS), 2 mM de L-glutamine, 1 puromycine μg/mL et 10 μg/mL blasticidine) à 37 ° C, 5 % CO2.Remarque : Plat-E cellules proviennent de cellules 293 t et expriment gag, pol et ecotropic protéines rétrovirales de l’enveloppe. Préparer la transfection des solutions médias 1et 2 immédiatement avant la transfection. Préparer la solution 1 (pH 7,9) pour contenir DMEM + 10 % FCS + 25 mM HEPES, solution 2 (pH 7,1) pour contenir DMEM + 25 mM HEPES. Préparer 10 μg/mL de solution de fragment fibronectine humaine recombinante en diluant avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et conserver à-20 ° C jusqu’à l’utilisation. STERILE filtrer sur tous les médias 0,2 μm filtres avant utilisation (à l’exclusion des fragment de fibronectine humaine recombinante). 2. retroviral Transduction des lymphocytes T Jour 1 : Préparation pour la transfection Graine 7,5 x 106 Platinum-E (Plat-E) des cellules dans les plats de vitroplants de2 de 15 cm à 18 mL de DMEM complet et incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2. Jour 2 : Transfection de lignée de cellules de rétroviraux emballage Plat-E Préparer les 20,4 μg du vecteur d’emballage pcl-Eco ADN, 39,6 μg d’ADN de plasmide codant retroviral construction de voiture et 150 μL de 1 M CaCl2 , pour un volume final de 3 mL de solution 2 transfection par plat de 15 cm2 à transfecter. Vortexer pendant 10 s et reste pendant 5 min Enlevez DMEM média les plats2 de 15 cm et remplacer avec 12 mL de solution de transfection 1.Mise en garde Lorsque vous modifiez les médias, les plats de2 cm 15 peuvent sécher au centre. Ceci peut causer la mort substantielle de cellules transfectées de Plat-E. Travailler rapidement et retirer des médias de juste 1-2 plaques à la fois. Ajouter 3 mL de solution de transfection 2 contenant de l’ADN et CaCl2 à chaque plat de2 cm 15 goutte-à-goutte, uniformément sur chaque plaque. Balançant doucement les plaques avec un mouvement de gauche à droite pour 10 s. Incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit. Jour 3 : Préparation contenant virus du surnageant pour la transduction Remplacer les médias des cellules transfectées de plaque-E avec 18 mL remplir TCM et retournent à l’incubateur.Mise en garde Quand changer les plats de2 cm 15 médias peut sécher au centre. Ceci peut causer la mort substantielle de cellules transfectées de Plat-E. Travailler rapidement et retirer des médias de juste 1-2 plaques à la fois. Jour 3 : Isolement et in vitro activation des cellules T spléniques de souris Retirer la rate de souris BALB/c de 6-8-week-old décrites précédemment par Parkinson et al. 19 et immerge-les dans stérile, glacée, PBS dans un tube conique de 50 mL. Pince à épiler permet de transférer une rate à un tube de microtubes de 1,5 mL et homogénéiser à l’aide d’un pilon avec un minimum de force. Utiliser une pipette de 1000 μL et ~ 800 μL PBS pour transférer l’homogénat à une crépine de cellule pore 100 μm apposée sur un tube de 50 mL contenant 5 mL de PBS pour atteindre une suspension monocellulaire. Répétez l’étape 2.4.2 pour les rates supplémentaires. Ne pas dépasser 3 rates par tube.Mise en garde Splénocytes passés filtre peuvent forment des touffes si encore debout. Manuellement à jet hélicoïdal tubes par intermittence si traitement plusieurs rates pour éviter la cellule agglomérante. Restant des fragments sur la crépine de cellule plus empâté à l’aide d’un piston d’une seringue de 5 mL à l’aide de la force minimale. Supérieure à 20 mL avec du PBS. Couche la suspension cellulaire de 20 mL doucement sur 20 mL de média gradient de densité (Table des matières) dans un tube de 50 mL. Centrifuger la suspension obtenue superposée à 800 x g pendant 20 min et aucun frein rhéostatique. Récolter les cellules à couche d’interface à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et transférez dans un tube de 50 mL. Supérieure à 50 mL avec PBS et centrifuger à 800 g pendant 10 minutes pour laver. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules en MTC complet. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. La culture de cellules à une densité de 5 x 106 cellules/mL en MTC complète avec 30 ng/mL d’anticorps anti-CD3ε (Clone 11 145-2C), 30 ng/mL d’anticorps anti-CD28 (Clone 37,51), 100 U/mL recombinante humaine il-2 et recombinant de 2 ng/mL murins IL-7. Utilisez une fiole de vitroplants taille appropriée pour le volume des cellules prélevées.Remarque : Cellules présentatrices d’antigène–sont nécessaires pour l’activation des lymphocytes T par des anticorps CD3 et CD28, si travailler avec purifiée cellules de T, il est nécessaire de plaques de couche avec des anticorps, ou utilisent des billes magnétiques (Table des matières) Incuber les splénocytes de souris à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit. Jour 3 : Préparation des plaques pour la transduction Manteau sans tissu-culture 6 plats avec 2 mL de 10 μg/mL de fibronectine humaine recombinante fragmentent et incuber une nuit à 4 ° C. Jour 4 : Transduction des cellules de souris T Transfert en fragment de fibronectine humaine recombinante de plaques revêtues aux plaques de 6 puits non-culture de tissus frais. Ces incuber une nuit à 4 ° C pour le 2ème tour de la transduction. Ajouter 2 mL de la MTC dans chaque loge de planches originales de fragment-enduit de fibronectine humaine recombinante et laisser pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les liaisons non spécifiques. Récolter le surnageant contenant du rétrovirus de cellules transfectées de Plat-E dans les récipients de culture de tissu de 15 cm et remplacer avec 18 mL de TCM complet.Mise en garde Travailler rapidement pour éviter le dessèchement des cellules Plat-E.Remarque : Succès de la transfection peut être vérifiée à ce stade par microscopie de fluorescence si utilisant un gène marqueur fluorescent tels que mCherry (Figure 1). Le surnageant contenant du rétrovirus filtrer sur un filtre de 0,45 μm pour éliminer les débris cellulaires. Enlever TCM de fibronectine humaine recombinante fragment-enduit des plaques 6 puits et ajouter 2,5 mL de filtrée surnageant contenant du rétrovirus ou dans chaque cupule (utilisation toutes les TCM pour la transfection simulée). Étiquetez chaque puits quant à l’ajout de rétrovirus ou simulacre médiatique. Centrifuger les plaques à 1200 x g pendant 30 min à température ambiante. Tandis que les plaques sont filer, recueillir les lymphocytes T activés et compter à l’aide d’un hémocytomètre. La transduction est effectuée avec des splénocytes6 activé 5 x 10 sur un total de 5 mL par puits. Granule le nombre requis de splénocytes pour maquette/transduction dans des tubes distincts par centrifugation à 500 g pendant 5 min. Remettre en suspension les splénocytes à une densité de 5 x 106 cellules / 2,5 mL de surnageant de rétrovirus contenant filtré de l’étape 2.6.4 ou TCM comme témoin négatif. Ajouter recombinante il humain Property DelayValidation-2 Implements (hIL-2) et recombinante souris IL-7 (mIL-7) à une concentration finale de 200 UI/mL et 4 ng/mL respectivement. Recueillir des plaques 6 puits de la centrifugeuse à la fin de l’étape 2.6.5 et ajouter 2,5 mL/puits remises en suspension splénocytes dans les puits appropriés pour faire un volume final de 5 mL/bien et une concentration finale de 100 U/mL hIL-2 et 2 ng/mL mIL-7. Centrifuger les plaques à 1200 x g pendant 90 min à température ambiante. Après centrifugation, incuber les plaques à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit. Jour 5 : 2ème tour de la transduction Recueillir le fragment de fibronectine humaine recombinante des plaques comme cela peut être réutilisée. Répétez les étapes 2.6.2 – 2.6.5. Alors que les plaques sont filer, prélever des cellules du 1st round de transduction, à l’aide d’une pipette Pasteur. Rincer chaque puits avec 2 mL de PBS, agiter et recueillir les cellules restantes dans chaque puits.Remarque : Pipetter haut et bas pour remettre en suspension les cellules sédimentées. Collecter chaque groupe contrôle/transduction dans des tubes distincts. Tubes à centrifuger à 500 g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules en 2,5 mL par puits de transduction avec 200 UI/mL IL-2 et 4 ng/mL IL-7. Répétez les étapes 2.6.7 – 2.6.8. Éliminer les cellules de la centrifugeuse et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pour les cellules de 4 h. recueillir transduites comme étapes 2.7.2-2.7.3. Compter les cellules, centrifuger à 500 g pendant 5 min et remettre en suspension en MTC complète à une densité de 1 x 106 cellules/mL avec 100 U/mL hIL-2 et 2ng/mL mIL-7. Transférer dans une fiole de culture taille convenablement et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2. Ajouter des supports TCM neufs contenant 100U/mL hIL-2 et 2ng/mL mIL-7 tous les 2 jours, maintenir une densité cellulaire de 1 x 106 cellules/mL.Remarque : Splénocytes récoltés contiennent une variété de types de cellules. Dans ces conditions de culture, les cellules T non meurent au cours des 2 ou 3 jours. Après ~ 4 jours en culture cellulaire, le nombre de lymphocytes T est généralement équivalent au nombre total de splénocytes récoltés le jour 0. 3. mesure de l’efficacité de la Transduction Sur la transduction de post J4, prélever un échantillon de cellules de T transduits ou non-transduites (environ 3 x 105 cellules). Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant, laver les cellules pressés une fois avec du PBS et centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant et ajouter 100 μl de PBS contenant un colorant réactif amine approprié (par exemple, tache de vivre/morts, dilution de 1 à 100) / puits. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Laver deux fois avec du PBS et centrifuger à 500 g pendant 5 min. jeter le surnageant et incuber avec 50 μL de tampon de FACS contenant des anticorps anti-souris du CD16/CD32 pour récepteurs Fc (dilution de 1 à 100). Incuber pendant 10 min à 4 ° C. Directement ajouter 50 μL d’anticorps coloration mélange principal contenant anti-souris BV786 CD4 et CD8-BV711 anticorps (concentration finale de 1 μL/puits dans le tampon de FACS). Incuber 30 min à 4 ° C dans l’obscurité. Répétez l’étape de lavage 3.3. Remettre en suspension les cellules dans un tampon 1 % PFA et gardez les dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux. Analyser les cellules avec équivalent cytomètre approprié à l’aide de fluorescence BV711, BV785 et mCherry comme des marqueurs de sous-ensemble de CD4 et CD8 et expression de voiture gating respectivement (Figure 2). 4. in vitro les cellules de la Validation de voiture T activité Semences syngéniques ciblent CD19+ des cellules tumorales avec ou sans expression de la luciférase à une densité de 1 x 104 cellules dans 100 μL TCM/puits dans un fond U 96 puits plaque de culture de tissus. Ajouter 1 x 104 T voiture CD19 cellules/puits dans un volume de 100 μL/puits pour atteindre un effecteur ratio cible (E:T) de 1:1.Remarque : Ratios de E:T devraient être établis pour chaque voiture, construire et cibler la lignée cellulaire. Cellules d’utilisation T seul et seul comme témoins négatifs des cellules tumorales et des cellules T stimulées par phorbol-myristate-acétate (PMA) (50 ng/mL) et ionomycine (1 μg/mL) comme témoin positif pour la libération de l’interféron gamma (IFNγ). Cellules de co-culture à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 16 à 24 heures. Suite de co-culture, centrifuger les plaques à 500 g pendant 5 min et recueillir le surnageant pour une analyse ultérieure IFNγ et ELISA de IL – 12 p 70.Remarque : Cela peut être conservé à-80 ° C. Une nouvelle suspension pastilles de cellule dans 100 μl de PBS contenant la luciférine (concentration finale de 1,5 mg/mL). Incuber les boîtes pendant 10 min à 37 ° C. Mesurez ensuite la luminescence de chaque puits avec un luminomètre approprié.Remarque : Temps d’exposition doivent être optimisés pour la densité et de lignées cellulaires. Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 3 a. Ex vivo cytotoxicité des lymphocytes T de voiture peut être modifiée à la luciférine express par co-culture avec des lignées de cellules exprimant l’antigène cible. Comme cellules de T de voiture tuent les cellules cibles, luciférine est sorti, donc une réduction de luminometry signal est corrélée à tuer cell. Les cellules non-transduites peuvent souvent avoir un effet sur la viabilité des cellules cibles, particulièrement pendant les périodes d’incubation longue. Mesurer la concentration de la murine IFNγ et IL – 12p 70 dans le surnageant conformément aux protocoles ELISA du fabricant. Résultats représentatifs apparaissent (Figure 3 b et 3C). Ex-vivo activation de lymphocytes T de voiture par co-culture avec des lignées de cellules exprimant l’antigène cible peut être dosée par l’analyse de contenu surnageant à l’aide de ELISA. Le ratio de cellules de T de voiture pour cibler les cellules et la durée de la période de culture mixte doivent être optimisés pour chaque construction voiture, lignée de cellules de cible et d’analytes. Traitement de PMA et ionomycine peut servir de témoin positif pour confirmer la qualité des cellules T et leur capacité à réagir. 5. évaluer l’activité de lutte contre le cancer chez les souris Protocole n° 1 Effectuer la livraison par voie intraveineuse (IV) 100 mg/kg de cyclophosphamide chez des souris BALB/c 6 à 8 semaines. Cela permet la prise de greffe tumorale sans lymphodepletion significative17 (Figure 4).Remarque : Instituant l’A20 lymphome peut prendre plus de 2 mois avec un taux d’abonnement sous-optimale. Cela peut être améliorée par l’utilisation du cyclophosphamide 1 jour avant la livraison des cellules de lymphome. Afin d’étudier la lymphoreplete souris, nous avons identifié une dose de cyclophosphamide susceptibles d’accroître l’efficacité du lymphome sans causer de lymphodepletion. Le lendemain, injecter 100 µL de 5 x 105 syngénique A20 B-cell lymphoma cellules modifiées pour exprimer la luciférase et vert fluorescent protein (GFP) chez la souris par une injection intraveineuse (IV). Laissez les souris de développer un lymphome systémique pour ~ 17 jours. Confirmer la présence de lymphome systémique par une injection intrapéritonéale (IP) de 100 μL de luciférine de 30 mg/mL et d’imagerie utilisant une bioluminescence in vivo , système d’imagerie. Utiliser séparateurs pour éviter débordement de signal à des souris adjacentes. Exposer les souris pendant 1 min sur la face ventrale avec une région de taille constante d’intérêt. Affiche les unités de lumière relatives (RLU) photons par seconde (p/s). Paramètres doivent être optimisées pour chaque modèle de tumeur ; Utilisez une exposition qui peut ramasser la détection précoce des tumeurs, mais n’entraîne pas de saturation, comme les tumeurs atteignent des points de terminaison. Région d’intérêt de taille record RLU total pour chacune des souris avec une constante. (Figure 5 a et b). Injecter un lymphome d’une dose unique de 1 x 106 cellules de T de voiture par injection intraveineuse à des souris de lymphoreplete portant établi.Remarque : (Important) Niveaux de dosage doit être établi pour chaque voiture construire en utilisant un calendrier d’escalade de doses pour que toute toxicité possible des cellules de T de voiture est caractérisées et peut être abordées. Bien que les cellules T voiture CD19 anti-souris n’affichent pas les toxicités, lymphocytes T voiture peuvent donner lieu à toxicités inattendues. Lorsque plusieurs constructions de voiture et de l’efficacité de la transduction n’est pas identiques, le nombre total de lymphocytes T administré doit être égal par l’addition de non-transduites des cellules T dans des préparations de cellules. Surveiller la progression de la maladie par semaine par injection Intrapéritonéale de 100 μL de luciférine de 30 mg/mL et d’imagerie utilisant une bioluminescence in vivo d’imagerie système (Figure 5C). Suivre la souris des signes de toxicité de près et euthanasier une souris qui montrent les premiers signes de paralysie des membres postérieurs (HLP) ou fardeau tumoral pathologique avant toute souffrance peut survenir.Remarque : Toxicités de lymphome A20 peuvent inclure le membre postérieur paralysie par l’invasion de la tumeur des méninges. Vérifiez régulièrement pour les signes précoces d’altération de la démarche. De même, les grosses tumeurs IP peuvent survenir qui peut conduire à l’inconfort, illustré par un comportement altéré. Assurer la survie des souris pour 60 à 100 jours (Figure 5 d). Effectuer l’euthanasie par une méthode de formule-1 à l’issue de l’expérience. Protocole 2 Distribuer le cyclophosphamide 200 mg/kg à 6-8 – semaine vieilles souris BALB/c en queue injection dans la veine dans 100 μl de PBS par souris. Le lendemain, injecter de 5 x 105 syngénique A20 B-cell lymphoma cellules exprimant luciférase et GFP dans 100 μL PBS via queue injection dans la veine. Laissez les souris de développer des lymphomes systémiques pour ~ 7-14 jours Confirmer lymphome systémique par injection Intrapéritonéale de 100 μL de luciférine de 30 mg/mL et imagerie utilisant une bioluminescence in vivo , système d’imagerie. Effectuer 5 Gy irradiation corporelle totale (TBI) à 0,02 Gy/min pour lymphodepletion.Remarque : Patients subissant un traitement par voiture T-cellules subissent une série de schémas pour atteindre lymphodepletion avant l’administration de lymphocytes T de la voiture qui augmente de manière significative la prise de greffe de Moutschen transfert des cellules de T de voiture. Cela peut être reproduit chez les souris avec irradiation corporelle totale (TBI) (Figure 6). Le lendemain, injecter 1 x 106 cellules de T de voiture dans 100 μl de PBS via queue veine injection chez des souris ayant établie des tumeurs. Collecte sang échantillons via queue veine saigne après 7 jours. Ajouter le tampon de lyse des globules rouges à chaque échantillon de sang, puis préparer pour la cytométrie en flux, tel que décrit à l’article 3. Analyser la persistance de cellules de T de voiture dans la circulation par cytométrie en flux (Figure 2).Remarque : Ajout de comptage perles immédiatement avant la cytométrie en flux permet de déterminer le nombre de cellules de T de voiture par millilitre de sang. Surveiller la progression de la maladie comme décrit aux étapes 5.1.5 – 5.1.8 (Figure 7).