İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma
Summary
Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.
Abstract
Kardiyak progenitör hücre (TBM) kalp yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra yaralanma için tedavi potansiyeli olabilir. Yetişkin memeli kalbinde, içsel TBM’leri son derece kıt, ama genişletilmiş TBM’leri hücre tedavisi için yararlı olabilir. Yeteneklerini denetimli bir biçimde tanımlanmış ve etkin iletişim kuralları kullanılarak çeşitli kardiyak soy ayırt etmek için onların kullanmak için bir önkoşuldur. Ayrıca, vitro genişleme, üzerine TBM’leri hastalardan izole veya preklinik hastalık modelleri hastalığı mekanizmaları incelenmesi için verimli araştırma araçları sunabilir.
Mevcut çalışmalar farklı işaretleri TBM’leri tanımlamak için kullanın. Ancak, tüm bunların hangi preklinik bazı çalışmalar translasyonel etkisini sınırlar insanlarda, ifade edilir. Ne olursa olsun yalıtım tekniği ve marker ifade tabidir farklılaşma protokolleri için standart genişleme ve TBM astar hücre terapisi amaç için izin verir. Burada biz tarif endotel farklılaşma TBM’leri. fare ve sıçan TBM’leri iki farklı altgrupları kullanarak TBM’leri astar düşük fetal Sığır serum (FBS) konsantrasyon ve düşük hücre yoğunluğu koşullar altında kolaylaştırır, bir daha o laminin olduğunu göstereceğiz fibronektin aşağıdaki protokol altında bu amaçla daha uygun substrat: 2-3 gün içinde takviyeleri de dahil olmak üzere orta multipotency korumak için sonra kültür ve % 3,5 ile FBS, TBM laminin üzerinde numaralı seribaşı < % 60 izdiham ve kültürlü içinde Ek içermeyen orta FBS (% 0,1) düşük konsantrasyonlarda farklılaşma endotel farklılaşma orta önce 20-24 saat ile. TBM türdeş olmayan bir nüfus olduğundan, serum konsantrasyonları ve kuluçka süreleri ilgili TBM subpopulation özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Göz önüne alındığında bu, teknik diğer türleri TBM için de uygulanabilir ve potansiyel ve farklılaşma ve nasıl onlar hastalığı ile ilgili hastalık modellerden izole TBM'leri kullanırken etkilenen mekanizmaları araştırmak için yararlı bir yöntem sağlar.
Introduction
Son yıllarda yapılan çalışmalarda yetişkin memeli kalp1,2,3‘ te ikamet kardiyak progenitör hücre (TBM) varlığını desteklemek ve TBM’leri Kalp zedelenmesini4sonra, hücre tedavisi için yararlı bir kaynak olabilir 5. Buna ek olarak, genişletilmiş TBM’leri uyuşturucu tarama için verimli bir model sağlayabilir ve modellerinin nadir kardiyomiyopatiler hastalarda veya ilgili hastalık izole zaman hastalık mekanizmaları araştırma6,7.
Yetişkin yürekten izole TBM’leri sahip kök/progenitor hücre özellikleri1,2,3,8 multipotent, oldukları gibi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar, ve kendini yenilemesinin kapasitesine sahiptir. Ancak, birçok farklı (alt) nüfus dahil olmak üzere, farklı yüzey marker profillerini, örneğin, c-kit, ani kalp durması-1 ve diğerleri, sergilenmesi veya farklı yalıtım teknikleri (Tablo 1) tarafından alınan TBM’leri vardır. Bazı kültür ve farklılaşma protokollerine kurulan1,2,8,9,10,11,12oldunuz. 13,14,15,16,17,18. Bu protokoller çoğunlukla büyüme faktörü ve hangi kültürü çalışmalarının amacı göre ayarlanır ve bunun sonuçları ve sonuçları da farklılaşma verimliliği dahil olmak farklılıkları için açabilir serum içerik ile ilgili olarak değişir.
İmleç tabanlı yalıtım teknikleri:
TBM bir belirli yüzey marker ifade1,2,8,9,10,11,12,13 tarihinde bağlı izole olabilir ,14,15,16,17,18. Önceki çalışmalar, c-kit ve ani kalp durması-1 ikamet TBM’leri1,11,14,19,20yalıtmak için en iyi işaretleri olabilir öneririz. Bu işaretleri hiçbiri TBM için gerçekten özel olduğundan, kombinasyonları farklı işaretleri genellikle uygulanır. Örneğin, c-kit21seviyesinin düşük TBM’ler hızlı ise, c-kit Ayrıca mast hücreleri22, endotel hücreleri23ve hematopoetik kök/progenitor hücreler24de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerine göre ifade edilir. Ek bir sorun tüm işaretleri tüm türler arasında ifade edilir olmasıdır. Ani kalp durması-1, fare ama insan25içinde ifade için durum böyle. Bu nedenle, yalıtım işaretleri bağımsız iletişim kuralları kullanılarak klinik çalışmalarda ve insan numuneleri kullanılarak çalışmalar içinde görüş-in avantajlı olabilir.
Marker bağımsız yalıtım teknikleri:
TBM tecrit, öncelikle yüzey marker ifade bağımsız olan ama (Ayrıca bkz: Tablo 1) gerektiği gibi belirli işaret-pozitif subfractions ardışık seçime göre rafine birkaç önemli teknikler vardır. (1 yan nüfus (SP) tekniği aslında hematopoetik kök hücre ATP-bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılar27tarafından sızma DNA boya Höchst 3334226 yeteneği dayanan ilkel bir popülasyondaki karakterize. Kardiyak SP hücreler farklı gruplar tarafından izole ve işaretleri raporları2,8,13,14arasında bazı küçük farklılıklar ile çeşitli ifade etmek için bildirdi. (2) koloni oluşturan birim fibroblast hücreleri (CFU-Fs) başlangıçta belirlediğiniz dayalı mezenkimal stromal hücre (MSC) üzerinde-fenotip gibi. İzole MSCs koloni oluşumu ikna etmek için bulaşık sırası kültürlü. Bu koloni oluşturan-MSC benzeri CFU-Fs yetişkin yürekten ayrılmış olabilir ve kardiyak soy15ayırt etmek yeteneğine sahiptirler. (3) Cardiosphere kaynaklı hücreler (CDC) doku biyopsisi yetiştirilen hücre kümeleri elde tek hücrelerdir veya28,29,30,31explants. Son zamanlarda bu çoğunlukla CD105 gösterildi+/CD90–/c-kit– hücre kesir sergileyen cardiomyogenic ve rejeneratif potansiyel32.
Burada, SP-TBM’leri fareler izole kullanarak, biz bir protokol endotel lineage önceki çalışmada sıçan TBM’leri ve fare SP-TBM’leri33verimli indüksiyon için sağlar. Protokol kültürüne özgü uyarlamalar ve genişleme tekniği ile ilgili hücre yoğunluğu, orta sınıf ve substrat serum içeriğini içerir. Sadece fare SP-TBM’leri uygulanabilir ancak farklı TBM’leri amaç için bir endotel kaydedilmiş bir TBM yükseltecek üzerinden bir kader anahtarı ikna etmek için o içinde görüş-in bu hücreler veya kullanımları için mekanik vitro çalışmalar nakli olmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı avantajları:
Bu iletişim kuralı bir TBM endotel farklılaşma tekniği sağlar. Bulduğumuz bir düşük serum konsantrasyonu ve düşük hücre yoğunluğu endotel farklılaşma, mademki LN FN bu koşullar altında daha bir daha uygun substrat kanıtladı verimliliğini artırabilirsiniz. Biz TBM’leri iki ayrı türü kullanılır: fare hangi izole ve genişletilmiş bir hücre satırı benzeri şekilde ve fare SP-TBM’leri kullanılan, TBM,. Özellikle, protokol her iki t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Vera Lorenz deneyler ve personel Biyomedikal bölümü (DBM), üniversite ve Üniversite Hastanesi Basel akış sitometresi tesisinden sırasında ona yardımcı destek için teşekkür ederiz. Bu eser Stay-on parça programından Basel Üniversitesi (için Michika Mochizuki) tarafından desteklenmiştir. Gabriela M. Kuster İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant sayı 310030_156953) hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
