אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת בידול אנדותל עבור ובתאים הלב. הוא מתמקד במיוחד כיצד סרום ריכוז וצפיפות זורעות תא משפיעים על פוטנציאל התמיינות אנדותל.
Abstract
ובתאים הלב (CPCs) ייתכן טיפולית פוטנציאל התחדשות לב לאחר פציעה. בלב יונקים בוגרים, CPCs מהותי נדיר, אך CPCs המורחב יכול להיות שימושי עבור טיפול בתאי. תנאי הכרחי לשימוש שלהם הוא היכולת להתמיין בצורה מבוקרת שושלות לב שונים באמצעות פרוטוקולי מוגדר ויעיל. בנוסף, על הרחבת במבחנה , CPCs מבודדים מחולים או מחלות פרה מודלים עשויים להציע כלי מחקר פורה לחקירה של מנגנוני המחלה.
מחקרים נוכחיים להשתמש סמנים שונים לזיהוי CPCs. עם זאת, לא כולם באים לידי ביטוי אצל בני אדם, אשר מגביל את השפעת translational מחקרים פרה. פרוטוקולים בידול הרלוונטיים ללא קשר ההבעה טכניקה, סמן בידוד יאפשר הרחבת מתוקננת ואת לקרקע של CPCs לצורך טיפול תא. כאן נתאר כי לקרקע של CPCs תחת ריכוז נמוך סרום שור עוברית (FBS) ותנאי צפיפות נמוכה תא מקלה את הבידול אנדותל של CPCs. באמצעות שתי subpopulations שונות של עכבר, חולדה CPCs, אנו מראים ש-laminin את זה יותר המצע מתאימה יותר fibronectin למטרה זו תחת פרוטוקול הבאים: לאחר culturing במשך 2-3 ימים בינוני כולל תוספי תזונה זה לשמור על multipotency ועם 3.5% FBS, CPCs נזרע על laminin ב < 60% הנהרות ותרבותית ב ללא תוספת בינוני עם ריכוזים נמוכים של FBS (0.1%) 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. מאחר CPCs הם אוכלוסיה הטרוגנית, סרום ריכוזים ושעות הדגירה עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם המאפיינים של subpopulation בהתאמה עלות לקליק. בהתחשב בכך, הטכניקה ניתן להחיל על סוגים אחרים של CPCs כמו גם והוא מספק שיטה שימושית כדי לחקור את הפוטנציאל ואת המנגנונים של בידול, כיצד הן מושפעות על ידי מחלת בעת שימוש CPCs מבודד מן המחלה בהתאמה מודלים.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה לתמוך את קיומו של תושב ובתאים הלב (CPCs) של הלב יונקים בוגרים1,2,3, CPCs יכול להיות מקור שימושי עבור טיפול בתאי לאחר פציעה לב4, 5. בנוסף, CPCs המורחב עשוי לספק מודל פורה והתרופות הקרנה, החקירה של מנגנוני המחלה כאשר מבודדים מחולים עם cardiomyopathies נדירים, או ממחלת בהתאמה מודלים6,7.
CPCs מבודד בלב למבוגרים בעלי גזע/קדמון תא מאפיינים1,2,3,8 כפי שהם multipotent, clonogenic, יש יכולת התחדשות עצמית. עם זאת, ישנן אוכלוסיות שונות (sub) רבים של CPCs מפגין סמן משטח שונה פרופילים, כולל, למשל, c-kit, Sca-1 ואחרים, או שאוחזרו באמצעות טכניקות שונות בידוד (טבלה 1). מספר פרוטוקולים תרבות ובידול כבר הוקמה1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. פרוטוקולים אלה משתנים בעיקר ביחס גורם גדילה והתוכן סרום, אשר מותאמים בהתאם לצורך culturing, אשר יכול להוביל הבדלי תוצאות ותוצאות, לרבות יעילות בידול.
טכניקות בידוד המבוסס על סמן:
CPCs ניתן לבודד המבוסס על סמן משטח מסוים ביטוי1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים מצביעים כי c-kit, Sca-1 ייתכן הסמנים הכי טוב כדי לבודד תושב CPCs1,11,14,19,20. כי אף אחד סמנים אלה הוא באמת ספציפי CPCs, שילובים של סמנים שונים בדרך כלל מוחלים. לדוגמה, בעוד CPCs אקספרס רמות נמוכות של c-kit21, c-kit מתבטאת גם על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי פיטום22, תאי אנדותל23של תאי גזע hematopoietic/קדמון24. בעיה נוספת היא העובדה כי לא כל הסמנים מבוטאים על-פני כל המינים. זהו המקרה Sca-1, אשר מבטא את העכבר אך לא אנושי25. לכן, באמצעות פרוטוקולים שאינן תלויות סמני בידוד עשוי להיות יתרון על רקע ניסויים קליניים ומחקרים באמצעות דגימות אנושי.
סמן תלויית בידוד טכניקות:
ישנן מספר טכניקות העיקריים של עלות לקליק בידוד, אשר אינם תלויים בראש ובראשונה ביטוי סמן משטח, אך אשר יכול להיות מעודן על-ידי בחירת ברציפות subfractions סמן-חיובית מסוימת. כנדרש (ראה גם לוח 1). (1) הטכניקה האוכלוסייה (SP) צד במקור מלווה בקרב אוכלוסיה פרימיטיבית של תאי גזע hematopoietic מבוסס על היכולת בזרימת לצבוע דנ א Hoechst 3334226 ב- ATP-איגוד קלטת (ABC) מובילי27. תאי SP לב מבודדת על ידי קבוצות שונות ודיווח לבטא מגוון של סמנים עם כמה הבדלים משניים בין דוחות2,8,13,14. (2) יחידה המושבה יוצרי תאי פיברובלסט (CFU-Fs) במקור הוגדרו בהתבסס על תא סטרומה mesenchymal (MSC)-כמו פנוטיפ. MSCs מבודד מתורבתים על מנות לזירוז הקמת המושבה. כגון המושבה יוצרי MSC דמוי CFU-Fs ניתן לבודד מהלב למבוגרים, והם מסוגלים להתמיין שושלות לב15. (3) Cardiosphere נגזר תאים (CDC) הם תאים בודדים נגזר אשכולות של התאים גדלו של ביופסיות רקמות או explants28,29,30,31. זה הוצג לאחרונה זה בעיקר את CD105+/CD90–/c-kit– תא שבר מוצגים cardiomyogenic, פוטנציאל הרגנרציה32.
כאן, אנו באמצעות SP-CPCs מבודד מן העכברים, מספקים פרוטוקול אינדוקציה יעיל של השושלת אנדותל מבוסס על מחקר קודם CPCs חולדה, עכבר SP-CPCs33. הפרוטוקול מכיל עיבודים ספציפית לתרבות, טכניקה הרחבה לגבי צפיפות התאים, התוכן סרום של המדיום, ואת המצע. זה יכול לחול לא רק על העכבר SP-CPCs אך לסוגים שונים של CPCs למטרה לזירוז מתג גורל מ הגברה ל CPC אנדותל שבוצעו, יהיה זה על רקע השתלת תאים אלה או השימוש בהם ללימודי מכניסטית במבחנה .
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של פרוטוקול זה:
פרוטוקול זה מספק טכניקה בידול אנדותל של CPCs. מצאנו כי ריכוז בסרום נמוכה בעלת צפיפות נמוכה תא יכול לשפר את היעילות של בידול אנדותל, לפיה LN נוכחו להיות מצע מתאים יותר מאשר FN בתנאים אלה. . היינו שני סוגים שונים של CPCs: עכברוש CPCs, אשר היו בשימוש של התא, כמו קו בא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ורה לורנץ את תמיכתה מועיל במהלך הניסויים, והעובדים מהמתקן Flow Cytometry מן המחלקה וההתערבות (DBM), האוניברסיטה אוניברסיטת בית החולים באזל. עבודה זו נתמכה על ידי השהייה בעל המסלול לתוכנית של אוניברסיטת בזל (Michika מוצ’יזוקי). גבריאלה מ Kuster נתמך על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (310030_156953 מספר גרנט).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
