Индукция эндотелиальной дифференцировки в клетках сердечной Progenitor в условиях низкой сыворотки
Summary
Этот протокол описывает метод эндотелиальной дифференцировки клеток сердечной прародителя. Он особенно фокусируется на влияние эндотелиальной дифференцировки потенциал сывороточной концентрации и плотности заполнения ячейки.
Abstract
Сердца прогениторных клеток (CPC) могут иметь терапевтический потенциал для сердца регенерации после травмы. В самом взрослых млекопитающих внутренние цены за клик крайне скудны, но расширенная цены за клик может быть полезным для клеточной терапии. Предпосылкой для их использования является их способность дифференцироваться в различных сердца линий, используя протоколы определены и эффективно контролируемым образом. Кроме того после расширения в пробирке , СКПК изолированы от пациентов или модели доклинической болезни могут предложить плодотворное исследовательских инструментов для исследования механизмов болезни.
Текущие исследования используют различные маркеры для определения цены за клик. Однако не все из них выражаются в организме человека, который ограничивает поступательное воздействие некоторых доклинических исследований. Дифференциация протоколы, которые применяются независимо от изоляции технику и маркер выражения позволит стандартизированных расширения и грунтовки CPC для цели терапии клеток. Здесь мы опишем, что грунтовка СКПК условиях низкой плода бычьим сывороточным (ФБС) концентрации и плотность низкая клеток облегчает эндотелиальной дифференциации ставок CPC. Использование двух различных субпопуляций мыши и крысы CPC, мы покажем что Ламинин является более подходящий субстрат чем фибронектин для этой цели под следующий протокол: после культивирования для 2-3 дня в среде, включая добавки, поддерживать multipotency и с 3,5% FBS, цены за клик посеян на Ламинин в < 60% слияния и культивировали в дополнение свободной среды с низкой концентрацией FBS (0,1%), 20-24 часов до дифференциации в среде эндотелиальной дифференцировки. Потому что цена за клик гетерогенной популяции, концентрации в сыворотке и инкубации раз может потребоваться корректироваться в зависимости от свойства соответствующих КПК субпопуляция. Учитывая это техника может применяться для других типов ставок CPC также и предоставляет полезный метод исследовать потенциал и механизмы дифференциации и как они страдают от болезни, при использовании CPC, изолированных от соответствующих болезней модели.
Introduction
Недавние исследования поддерживают существование клетки-предшественники-резидентов сердца (CPC) в взрослых млекопитающих сердца1,2,3, и цены за клик может быть полезным источником для клеточной терапии после травмы сердца4, 5. Кроме того, расширенный CPC может обеспечить плодотворные модели для скрининга наркотиков и исследование механизмов болезни при изоляции от пациентов с редкими кардиомиопатии, или от соответствующих болезней модели6,7.
СКПК изолированы от взрослых сердца имеют стволовых/прогениторных клеток характеристики1,2,3,8 , поскольку они Multipotent с, колониеобразования, и имеют возможности для самообновления. Однако есть много различных (суб) населения СКПК экспонируется различные поверхности маркер профилей, включая, например, c комплект, Sca-1 и другие, или извлекается путем изоляции различных методов (Таблица 1). Некоторые культуры и дифференциации протоколы были установленным1,2,8,9,10,11,12, 13,14,,1516,17,18. Эти протоколы отличаются главным образом в том, что касается фактора роста и сыворотки содержания, которые корректируются в соответствии с целью культивирования и которые могут привести к различиям в результаты и результаты, включая дифференциацию эффективности.
Методы изоляции на основе маркера:
СКПК могут быть изолированы на основе конкретной поверхности маркер выражения1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,,1516,17,18. Предыдущие исследования показывают, что c комплект и Sca-1 может быть лучшим маркеры, чтобы изолировать резидентов СКПК1,11,14,19,20. Поскольку ни один из этих маркеров является поистине специфичным для CPC, обычно применяются комбинации различных маркеров. Например в то время как цены за клик Экспресс низкий уровень c комплект21, c комплект также выражается в другие типы клеток, включая тучные клетки22, эндотелиальные клетки23и гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток24. Дополнительной проблемой является тот факт, что не все маркеры выражаются через всех видов. Это случай для Sca-1, который выражает в мыши, но не в человека25. Таким образом используя протоколы, которые являются независимыми от изоляции маркеров может быть выгодным с учетом клинических испытаний и исследования с использованием человеческих образцов.
Маркер независимые изоляции методы:
Существует несколько основных методов изоляции КПК, которые являются главным образом независимо от поверхности маркер выражения, но который может быть уточнен подряд отбор конкретных маркер позитивных подфракций, при необходимости (см. также таблицу 1). (1 населения (SP) техника сторона первоначально было охарактеризовано в примитивных населения гемопоэтических стволовых клеток, основанный на способности измеряем ДНК краситель Hoechst 3334226 АТФ привязки кассеты (ABC) транспортеров27. Сердечной клетки SP были изолированы различными группами и сообщил, чтобы выразить различные маркеры с некоторые незначительные различия между доклады2,8,,1314. (2) блок формирование колонии фибробластов клетки (CFU-Fs) первоначально были определены основанные на мезенхимальных стромальных клеток (MSC)-как фенотипа. Изолированные MSCs культивированный на блюда для стимулирования формирования колонии. Такие колонии формирование MSC-как кое-Fs могут быть изолированы от взрослых сердца и способны дифференцироваться в сердечной линий15. (3) Cardiosphere производные клетки (CDC) представляют собой отдельные ячейки, производные от кластеры клеток, выращенных из биопсии ткани или эксплантах28,,2930,31. Недавно было показано, что главным образом CD105+/CD90–/c-kit– клетки часть экспонатов cardiomyogenic и восстановительной потенциальных32.
Здесь используя SP-СКПК изолированы от мышей, мы предоставляем протокол для эффективной индукции эндотелиальной линии, основанный на предыдущем исследовании СКПК крысы и мыши SP-СКПК33. Протокол содержит конкретные адаптации к культуре и расширения техника связи плотность клеток, содержание сыворотки средних и субстрата. Он может применяться не только к мыши SP-CPC, но различные виды ставок CPC для цели побудить судьба переход от комнатного эндотелия, совершенные КПК, будь то с учетом пересадки этих клеток или их использования в механистической в vitro исследования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества этого протокола:
Этот протокол обеспечивает метод эндотелиальной дифференцировки CPC. Мы обнаружили, что низкий сывороточной концентрации и плотность низкая клеток может повысить эффективность эндотелиальной дифференцировки, whereby LN, оказался более подходящ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят вера Лоренц за ее полезные поддержку во время экспериментов и сотрудников из объекта потока цитометрии от Департамента биомедицины (ДБМ), университета и Университетская больница в Базеле. Эта работа была поддержана пребывание на дорожке программы из Базельского университета (Michika Мотидзуки). Gabriela M. Кастер поддерживается грант от Швейцарский Национальный научный фонд (Грант номер 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
