Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden
Summary
Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.
Abstract
Cardiale voorlopercellen (CPC) wellicht therapeutisch potentieel voor cardiale herstel na blessure. In de volwassen zoogdieren hart, intrinsieke CPCs zijn uiterst schaars, maar uitgebreide CPCs zou nuttig voor celtherapie. Een voorwaarde voor het gebruik ervan is hun vermogen om te onderscheiden op een gecontroleerde manier in de diverse cardiale geslachten gedefinieerd en efficiënte protocollen gebruiken. Bovendien, bij in vitro expansie, CPC’s die bij patiënten geïsoleerd zijn of preklinische ziekte modellen vruchtbare onderzoeksmiddelen voor het onderzoek naar de ziekte mechanismen kunnen bieden.
Huidige studies gebruiken verschillende markeringen ter identificatie van CPC. Echter zijn niet alle van hen uitgedrukt in mens, die beperkt de translationeel impact van sommige Preklinische studies. Differentiatie-protocollen die zijn van toepassing ongeacht de isolatie-techniek en marker-expressie zal voor de gestandaardiseerde uitbreiding en priming van CPC’s voor cel therapie doel toestaan. Hier beschrijven we dat de priming van CPC’s onder een lage foetale runderserum (FBS) concentratie laag cel dichtheid vergemakkelijkt de endothelial differentiatie van het CPCs. met behulp van twee verschillende subpopulaties van muis en rat CPCs, we laten zien dat laminin is een meer geschikt substraat dan fibronectine daartoe krachtens het volgende protocol: na het kweken voor 2-3 dagen in medium met inbegrip van de supplementen die multipotent handhaven en met 3,5% FBS, CPCs worden overgeënt op laminin op < 60% samenvloeiing en gekweekte in supplement-gratis medium met lage concentraties van FBS (0,1%) voor 20-24 uur voor differentiatie in endotheel differentiatie medium. Omdat het CPCs zijn een heterogene populatie, wellicht serum concentraties en incubatie tijden worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de respectieve CPC subpopulatie. Gezien dit, de techniek kan worden toegepast op andere soorten CPCs ook en biedt een handige methode om te onderzoeken van het potentieel en de mechanismen van differentiatie en hoe ze worden beïnvloed door ziekte bij het gebruik van CPC's geïsoleerd van de respectieve ziekte modellen.
Introduction
Recente studies ondersteunen het bestaan van resident cardiale voorlopercellen (CPC) in de2,van volwassen zoogdieren hart1,3, en CPC’s zou een nuttige bron voor celtherapie na cardiale letsel4, 5. Bovendien uitgebreide CPCs kunnen voorzien in een vruchtbare model drug screening en het onderzoek naar de ziekte mechanismen als geïsoleerde patiënten met zeldzame aandoeningen, of aan respectieve ziekte modellen6,7.
CPC’s geïsoleerd van de volwassen hart bezitten stam/progenitor cel kenmerken1,2,3,8 , zoals ze multipotente zijn, clonogenic, en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing. Echter, er zijn veel verschillende (sub) bevolking van CPC’s verschillende oppervlakte marker profielen, met inbegrip van, bijvoorbeeld, c-kit, Sca-1 en anderen, tentoonstellen of opgehaald door verschillende isolatie technieken (tabel 1). Diverse protocollen van de cultuur en de differentiatie zijn gevestigde1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Deze protocollen verschillen meestal met betrekking tot de groeifactor en serum inhoud, die zijn aangepast aan het doel van het kweken en die kan leiden tot verschillen in de resultaten en effecten, met inbegrip van differentiatie efficiëntie.
Marker gebaseerde isolatie technieken:
CPC’s kunnen worden geïsoleerd op basis van een specifieke oppervlakte marker expressie1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Eerdere studies suggereren dat de c-kit en Sca-1 de beste markers zijn kunnen te isoleren van de resident CPCs1,11,14,19,20. Omdat geen van deze markers echt specifiek voor CPC is, worden combinaties van verschillende markeringen gewoonlijk toegepast. Bijvoorbeeld, terwijl het CPCs express lage niveaus van c-kit21, is c-kit ook uitgedrukt door andere celtypes, met inbegrip van mestcellen22, endotheliale cellen23en hematopoietische stamcellen/voorlopercellen cellen24. Een bijkomend probleem is het feit dat niet alle markeertekens worden uitgedrukt in alle soorten. Dit is het geval voor Sca-1, die in de muis maar niet in menselijke25 uitdrukt. Met behulp van protocollen die onafhankelijk van isolatie markeringen zijn kan dus voordelig met het oog op klinische proeven en studies met menselijke specimens.
Marker-onafhankelijke isolatie technieken:
Er zijn verschillende belangrijke technieken voor CPC-isolatie, die vooral onafhankelijk zijn van oppervlakte marker expressie, maar die kunnen worden verfijnd door de opeenvolgende selectie van specifieke marker-positieve subfractions zo nodig (Zie ook tabel 1). (1) de kant bevolking (SP) techniek was oorspronkelijk gekenmerkt in een primitieve bevolking van hematopoietische stamcellen, gebaseerd op de mogelijkheid om de DNA kleurstof Hoechst 3334226 efflux van ATP-binding cassette (ABC) vervoerders27. SP hartcellen zijn geïsoleerd door verschillende groepen en gerapporteerd om uit te drukken een scala aan markeringen met enkele kleine verschillen tussen rapporten2,8,13,14. (2) kolonie-vormende eenheid fibroblast cellen (CFU-Fs) zijn oorspronkelijk vastgesteld gebaseerd op een mesenchymale stromale cel (MSC)-als fenotype. Geïsoleerde MSCs worden gekweekt op gerechten voor het opwekken van de vorming van de kolonie. Dergelijke kolonie-vormende MSC-achtige CFU-Fs kunnen worden geïsoleerd uit het volwassen hart en zijn in staat om het verschil in cardiale lineages15. (3) Cardiosphere-afgeleide cellen (CDC) zijn afzonderlijke cellen afgeleid van clusters van cellen gegroeid van weefsel biopsieën of28,29,30,31explants. Het werd onlangs aangetoond dat meestal de CD105+/CD90–/c-kit– cel breuk vertoont cardiomyogenic en regeneratieve potentiële32.
Hier, voorzien wij een protocol met behulp van SP-CPC’s geïsoleerd van muizen, voor de efficiënte inductie van endothelial overdrachtslijn op basis van een eerdere studie in het CPCs rat en muis SP-CPCs33. Het protocol bevat specifieke aanpassingen aan de cultuur en techniek van de uitbreiding met betrekking tot de celdichtheid, de serum-inhoud van het medium, en het substraat. Het kan worden toegepast op muis SP-CPC’s niet alleen maar aan verschillende soorten-CPC’s voor het doel voor het opwekken van de overstap van een lot van een sturen naar een CPC endotheel-begaan, zij het met het oog op de transplantatie van deze cellen of het gebruik ervan voor mechanistische in vitro studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voordelen van dit Protocol:
Dit protocol biedt een endothelial differentiatie techniek van het CPCs. We vonden dat een lage serumconcentratie en lage celdichtheid de efficiëntie van endothelial differentiatie, waarbij LN bleek te zijn een meer geschikte substraat dan FN onder deze omstandigheden zou kunnen verbeteren. We gebruikten twee verschillende soorten CPCs: rat CPCs, die werden gebruikt in een cel lijn-achtige wijze, en muis SP-CPC’s, die werden geïsoleerd en uitgebreid. Met name het pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Vera Lorenz voor haar nuttige ondersteuning tijdens de experimenten en het personeel van de Stroom Cytometry faciliteit van het departement van biogeneeskunde (DBM), de Universiteit en de Universiteit ziekenhuis Bazel. Dit werk werd gesteund door het verblijf-on track program van de Universiteit van Bazel (tot Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster wordt ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nummer 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
