Induzione di differenziazione endoteliale in cellule progenitrici cardiache in condizioni di basso del siero
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di differenziazione endoteliale di cellule progenitrici cardiache. Si concentra in particolare su come la concentrazione nel siero e la densità di semina delle cellule influenzano il potenziale di differenziazione endoteliale.
Abstract
Cellule progenitrici cardiache (CPCs) possono avere potenziale terapeutico per la rigenerazione cardiaca dopo la ferita. Nel cuore dei mammiferi adulto, intrinseca CPC sono estremamente scarse, ma espanso CPCs potrebbe essere utile per la terapia cellulare. Un prerequisito per il loro uso è la loro capacità di differenziarsi in modo controllato nei vari lignaggi cardiaci utilizzando protocolli definiti ed efficienti. Inoltre, all’espansione in vitro , CPCs isolati da pazienti o malattia preclinica modelli possono offrire strumenti di ricerca fruttuosa per l’indagine sui meccanismi della malattia.
Gli studi correnti utilizzano differenti marcatori per identificare CPCs. Tuttavia, non tutti sono espressi in esseri umani, che limita l’impatto traslazionale di alcuni studi preclinici. Protocolli di differenziazione che siano applicabili indipendentemente dall’espressione tecnica e marcatore di isolamento consentirà l’espansione standardizzati e adescamento di CPC per scopo di terapia cellulare. Qui descriviamo che facilita l’innesco di CPC sotto una concentrazione bassa nel siero bovino fetale (FBS) e condizioni di densità bassa delle cellule la differenziazione endoteliale del CPCs. utilizzando due differenti sottopopolazioni di topo e di ratto CPCs, indichiamo che laminin è un più substrato adatto di fibronectina per questo scopo sotto il seguente protocollo: dopo la coltura per 2-3 giorni in mezzo compresi gli integratori che mantenere multipotenza e con 3,5% FBS, CPC sono seminati su laminina a < 60% confluenza e coltivate in medium senza supplemento con basse concentrazioni di FBS (0,1%) per 20-24 ore prima differenziazione in mezzo di differenziazione endoteliale. Perché CPC sono una popolazione eterogenea, le concentrazioni nel siero e tempi di incubazione potrebbero essere necessario essere regolata a seconda delle proprietà della sottopopolazione rispettiva CPC. Considerando questo, la tecnica può essere applicata ad altri tipi di CPC anche e fornisce un metodo utile per studiare i meccanismi di differenziazione e come essi sono influenzati dalla malattia quando si utilizza il CPCs isolato dai modelli rispettivi malattia e potenziale.
Introduction
Gli studi recenti sostengono l’esistenza di cellule progenitrici cardiache residenti (CPCs) nel cuore di un mammifero adulto1,2,3, e CPC potrebbe essere una fonte utile per la terapia cellulare dopo lesione cardiaca4, 5. Inoltre, espanso CPCs può fornire un modello fecondo per lo screening di stupefacenti e lo studio dei meccanismi di malattia quando isolati da pazienti con rare malattie del miocardio o da malattia rispettiva modelli6,7.
CPC isolate da cuore adulto possiedono cellule staminali/progenitrici delle cellule caratteristiche1,2,3,8 come sono multipotenti, clonogeniche, e hanno la capacità di auto-rinnovamento. Tuttavia, ci sono molti differenti (sotto) popolazioni di CPC che presentino profili marcatore di superficie differenti, tra cui, ad esempio, c-kit, Sca-1 e altri, o estratto mediante tecniche di isolamento diverso (tabella 1). Diversi protocolli di differenziazione e cultura sono stati stabiliti1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Questi protocolli variano soprattutto per quanto riguarda il fattore di crescita e il contenuto di siero, che vengono regolati in base allo scopo della coltura e che possono causare differenze nei risultati e risultati, compresa l’efficienza differenziazione.
Tecniche di isolamento basati su marker:
CPC può essere isolato basato su un indicatore della superficie specifica espressione1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Gli studi precedenti suggeriscono che il c-kit e Sca-1 può essere i migliori marcatori per isolare residente CPCs1,11,14,19,20. Perché nessuno di questi indicatori è veramente specifica per CPCs, solitamente vengono applicate le combinazioni di marcatori diversi. Ad esempio, mentre CPCs esprimono bassi livelli di c-kit21, c-kit è espressa anche da altri tipi di cellule, tra cui mastociti22, cellule endoteliali23e di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche24. Un ulteriore problema è il fatto che non tutti gli indicatori sono espressi in tutte le specie. Questo è il caso per Sca-1, che si esprime nel topo ma non nell’umano25. Pertanto, utilizzando protocolli che sono indipendenti di marcatori di isolamento può essere vantaggioso in considerazione studi clinici e studi utilizzando campioni umani.
Tecniche di isolamento di marcatore indipendente:
Ci sono diverse tecniche principali di isolamento CPC, che sono principalmente indipendenti dell’espressione dei marker di superficie, ma che può essere affinata dalla selezione consecutiva di specifici marcatori positivi subfractions come necessario (vedere anche tabella 1). (1) la tecnica di popolazione (SP) lato originalmente è stata caratterizzata in una primitiva popolazione di cellule staminali ematopoietiche basato sulla capacità di deflusso il colorante DNA Hoechst 3334226 di ATP-binding cassette (ABC) trasportatori27. Cellule cardiache SP sono state isolate da diversi gruppi e segnalate per esprimere una varietà di indicatori con alcune lievi differenze tra rapporti2,8,13,14. (2) le cellule del fibroblasto unità formazione di colonie (CFU-Fs) originalmente sono state definite basato su una cellula stromal mesenchymal (MSC)-come il fenotipo. MSCs isolato sono coltivate su piatti per indurre la formazione della Colonia. Tale formazione di colonie MSC-come CFU-Fs possono essere isolate da cuore adulto e sono in grado di differenziarsi in lignaggi cardiaco15. (3) cellule cardiosfere (CDC) sono singole cellule derivate da aggregati di cellule coltivate da biopsie dei tessuti o espianti28,29,30,31. Recentemente è stato dimostrato che per lo più il CD105+/CD90 frazione di cellule /c-kit– –esibisce cardiomiogenici e potenziale rigenerativo32.
Qui, utilizzando SP-CPCs isolate da topi, forniamo un protocollo per l’induzione efficiente di stirpe endothelial basato su uno studio precedente in ratto CPCs e mouse SP-CPCs33. Il protocollo contiene specifici adattamenti alla cultura e tecnica di espansione per quanto riguarda la densità delle cellule, il contenuto di siero del mezzo e il substrato. Esso può essere applicato non solo al mouse SP-CPC ma di diversi tipi di CPC per lo scopo di indurre un interruttore di destino da un’amplificazione di un CPC endoteliale commesso, sia esso in considerazione il trapianto di queste cellule o dal loro impiego per gli studi meccanicistici in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantaggi di questo protocollo:
Questo protocollo fornisce una tecnica di differenziazione endoteliale di CPC. Abbiamo trovato che una concentrazione bassa nel siero e la densità delle cellule basso potrebbe migliorare l’efficienza della differenziazione endoteliale, per cui LN ha dimostrato di essere un substrato più adatto di FN in queste condizioni. Abbiamo usato due tipi distinti di CPC: ratto CPCs, che sono stati utilizzati in maniera linea-come delle cellule e mouse SP-CPC, che sono stati …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Vera Lorenz per il suo sostegno utile durante gli esperimenti e il personale dell’impianto di citometria a flusso dal dipartimento di biomedicina (DBM), Università e ospedale universitario di Basilea. Questo lavoro è stato supportato dal soggiorno-su pista programma presso l’Università di Basilea (per Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster è sostenuta da una sovvenzione della Swiss National Science Foundation (concessione numero 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
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