Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique
Summary
Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.
Abstract
Progéniteurs cardiaques (CPCs) peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour la régénération cardiaque après une blessure. Dans le cœur des mammifères adult, CPCs intrinsèques sont extrêmement rares, mais élargis CPC pourraient être utiles pour la thérapie cellulaire. Une condition préalable à leur utilisation est leur capacité à se différencier de manière contrôlée dans les diverses lignées cardiaques à l’aide de protocoles définis et efficaces. En outre, lors de l’expansion in vitro , CPCs isolement de patients ou modèles précliniques de maladies peuvent offrir des outils de recherche fructueux pour l’étude des mécanismes des maladies.
Les études en cours permet d’identifier les CPCs différents marqueurs. Cependant, tous ne sont exprimés chez les humains, qui limite l’impact translationnelle de certaines études précliniques. Protocoles de différenciation qui s’appliquent quelle que soit l’expression technique et marqueur d’isolation permettra l’expansion normalisée et l’amorçage des SCD fins de thérapie cellulaire. Nous décrivons ici que l’amorçage des SCD dans des conditions de densité faible et une concentration faible sérum fœtal (SVF) facilite la différenciation endothéliale de CPCs. à l’aide de deux différentes sous-populations de souris et rat CPCs, nous montrons que la laminine est un plus substrat approprié que la fibronectine, à cet effet sous le protocole suivant : après mise en culture pour 2 ou 3 jours en moyenne, y compris les suppléments qui maintenir multipotentialité et avec 3,5 % FBS, SCD sont ensemencées sur laminin à < 60 % confluence et cultivées dans milieu sans supplément avec de faibles concentrations de FBS (0,1 %) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. CPCs étant une population hétérogène, les concentrations sériques et temps d’incubation devrez peut-être être ajustée en fonction des propriétés de la sous-population de CPC respectif. Compte tenu de cela, la technique peut être appliquée à d’autres types de CPCs ainsi et fournit une méthode utile pour étudier le potentiel et les mécanismes de différenciation et comment ils sont touchés par la maladie lors de l’utilisation de CPCs isolées de modèles de maladies respectives.
Introduction
Des études récentes soutiennent l’existence de progéniteurs cardiaques résidents (CPCs) dans le cœur des mammifères adultes1,2,3, et CPC pourraient constituer une source utile pour la thérapie cellulaire après lésion cardiaque4, 5. en outre, CPCs élargis peuvent fournir un modèle fructueux pour le dépistage des drogues et l’étude des mécanismes de la maladie quand isolées de patients atteints de cardiomyopathie rare, ou contre les maladies modèles6,7.
SCD isolé du cœur adultes possède des souches/progénitrices cellule caractéristiques1,2,3,8 car ils sont multipotentes, clonogéniques, et ont la capacité d’auto-renouvellement. Cependant, il y a beaucoup de populations différentes (void) des SCD présentant des profils de différents marqueurs de surface, y compris, par exemple, c-kit, Sca-1 et autres, ou récupérée par les techniques d’isolation différents (tableau 1). Plusieurs protocoles de culture et de la différenciation ont été établies1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Ces protocoles varient principalement en ce qui concerne le facteur de croissance et de la teneur en sérum, qui sont ajustés selon le dessein de la culture et qui peut conduire à des différences dans les résultats, y compris l’efficacité de la différenciation.
Techniques d’isolement basé sur le marqueur :
Les CPC peuvent être isolés basé sur un marqueur de surface spécifique expression1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Des études antérieures suggèrent que le c-kit et Sca-1 peuvent être les meilleurs marqueurs pour isoler les résidents SCD1,11,14,19,20. Car aucun de ces marqueurs est vraiment spécifique pour les CPC, combinaisons de différents marqueurs sont généralement appliqués. Par exemple, tandis que la SCD expriment des niveaux faibles de c-kit21, c-kit s’exprime également par d’autres types de cellules, y compris les mastocytes22, cellules endothéliales23et de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques24. Un autre problème est le fait que pas tous les marqueurs sont exprimés dans l’ensemble de toutes les espèces. C’est le cas pour Sca-1, qui se déclare chez la souris mais pas chez les humains25. Par conséquent, en utilisant les protocoles qui sont indépendants des marqueurs de l’isolement peut être avantageuse au vu des essais cliniques et études à l’aide d’échantillons humains.
Techniques d’isolement indépendant du marqueur :
Il y a plusieurs techniques majeurs d’isolement de la CPC, qui dépendent principalement de l’expression du marqueur de surface, mais qui peut être affinée par la sélection consécutive des sous-fractions de marqueurs positifs spécifiques si nécessaire (voir également tableau 1). (1) la technique de population (SP) de côté a initialement été caractérisée chez une population primitive de cellules souches hématopoïétiques, basé sur la capacité d’efflux de la teinture d’ADN Hoechst 3334226 par ATP-binding cassette (ABC) transporteurs27. Les cellules cardiaques de SP ont été isolés par différents groupes et signalés d’exprimer une variété de marqueurs avec quelques différences mineures entre les rapports2,8,13,14. (2) cellules de fibroblaste unité formant colonie (UFC-Fs) ont été définis initialement basé sur une cellule stromale mésenchymateuse (CSM)-comme le phénotype. MSCs isolés sont cultivées sur la vaisselle pour induire la formation de colonies. Tel formatrices MSC-comme UFC-Fs peut être isolé du cœur adult et sont capables de se différencier en lignées cardiaque15. (3) Cardiosphere-dérivés des cellules (CDC) sont de simples cellules provenant d’amas de cellules issues de biopsies tissulaires ou explants28,29,30,31. Il a été démontré récemment que pour la plupart la CD105+/CD90 fraction de cellules /c-kit– –pièces cardiomyogénique et potentiel régénératif32.
Ici, à l’aide de SP-CPCs isolés de souris, nous fournissons un protocole pour l’induction efficace de lignée endothéliale basée sur une étude antérieure au SCD de rat et souris SP-SCD33. Le protocole contient des adaptations spécifiques à la culture et technique de l’expansion en ce qui concerne la densité de la cellule, le contenu du sérum du milieu et le substrat. Il peut être appliqué non seulement aux souris SP-SCD, mais aux différents types de CPC dans le but d’induire un commutateur sort d’une amplification à un CPC endothéliales-commis, que ce soit en vue de la transplantation de ces cellules ou leur utilisation pour des études mécanistiques in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Avantages du présent protocole :
Ce protocole prévoit une technique de différenciation endothéliale des SCD. Nous avons constaté qu’une concentration sérique et la densité cellulaire faible pourraient améliorer l’efficacité de la différenciation endothéliale, auquel cas LN s’est avéré pour être un substrat plus adapté que le FN dans ces conditions. Nous avons utilisé deux types distincts de CPCs : rat CPC, qui ont été utilisés dans une manière ligne cellulaire et souri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Vera Lorenz pour son soutien utile pendant les expériences et le personnel de l’installation de cytométrie en flux du département de biomédecine (DBM), l’université et hôpital de l’Université Bâle. Ce travail a été soutenu par le séjour-sur piste programme de l’Université de Bâle (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster est soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention numéro 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
