تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة
Summary
ويصف هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لخلايا القلب السلف. لا سيما وهو يركز على كيف تؤثر على إمكانيات التمايز غشائي تركيز المصل وكثافة البذر الخلية.
Abstract
قد تكون الخلايا السلف القلب (Cpc) الإمكانات العلاجية لتجديد القلب بعد الإصابة. في قلب الثدييات الكبار، Cpc الجوهرية شحيحة للغاية، ولكن تكلفة النقرة موسعة يمكن أن تكون مفيدة للعلاج بالخلايا. شرطا مسبقاً لاستخدامها هو قدرتها على التفريق بطريقة الخاضعة للرقابة في الأنساب القلب المختلفة باستخدام بروتوكولات محددة وتتسم بالكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، عند التوسع في المختبر ، Cpc المعزولة من المرضى أو نماذج المرض الإكلينيكية قد توفر أدوات البحث المثمر لتحقيق آليات المرض.
الدراسات الحالية استخدام علامات مختلفة لتحديد تكلفة النقرة. ومع ذلك، ليس كل منهم يعبر عن البشر، مما يحد من تأثير متعدية الجنسيات من بعض الدراسات الإكلينيكية. سوف تسمح البروتوكولات التمايز قابلة للتطبيق بغض النظر عن التعبير عزلة تقنية وعلامة لتوسيع موحدة وفتيلة Cpc لغرض العلاج خلية. هنا يصف لنا أن فتيلة من تكلفة النقرة تحت تركيز مصل بقرى الجنين منخفضة (FBS) وخلية منخفض الكثافة ظروف تسهل غشائي التفريق بين استخدام اثنين من الفئات السكانية الفرعية المختلفة من الماوس وفار Cpc-Cpc، نظهر أن laminin أكثر الركيزة مناسبة من فيبرونيكتين لهذا الغرض بموجب البروتوكول التالي: بعد استزراع عن 2-3 أيام في المتوسط بما في ذلك المكملات الغذائية أن الحفاظ على مولتيبوتينسي ومع 3.5% FBS، Cpc هي تبذر في لامينين في < التقاء 60% ومثقف في المتوسط خالية من الملحق بتركيزات منخفضة من FBS (0.1 ٪) لمدة 20-24 ساعة قبل التمايز في متوسطة التمايز بطانية. نظراً لتكلفة النقرة عدد سكان غير متجانسة، تركيزات مصل الدم ومرات الحضانة قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لخصائص يتدنى التصنيف الخاصة بكل منها. ونظرا لهذا، يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من تكلفة النقرة، فضلا عن التقنية ويوفر وسيلة مفيدة للتحقيق في إمكانية وآليات للتمايز وكيف أنها تتأثر بالمرض عند استخدام Cpc معزولة عن نماذج المرض كل منهما.
Introduction
دعم الدراسات التي أجريت مؤخرا وجود خلايا السلف القلب المقيم (Cpc) في قلب الثدييات الكبار1،2،3، وتكلفة النقرة يمكن أن يكون مصدرا مفيداً لعلاج الخلايا بعد إصابة القلب4، 5-وباﻹضافة إلى ذلك، Cpc الموسعة قد تقدم نموذجا مثمرا لفحص المخدرات والتحقيق في آليات المرض عند معزولة من مرضى القلب نادرة، أو من المرض كل نماذج6،7.
Cpc معزولة عن قلب الكبار تمتلك الجذعية/السلف خلية الخصائص1،2،،من38 كما مولتيبوتينت، كلونوجينيك، ولديها القدرة على التجدد الذاتي. ومع ذلك، هناك العديد من السكان مختلفة (الفرعية) لتكلفة النقرة نستعرض الملامح ماركر السطحية المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، ج-كيت، 1 هيئة الأوراق المالية، وغيرها، أو استردادها بواسطة تقنيات العزل المختلفة (الجدول 1). وكانت عدة بروتوكولات الثقافة والتمايز المنشأة1،2،،من89،10،،من1112، 13،،من1415،16،،من1718. وتختلف هذه البروتوكولات معظمها يتعلق بعامل النمو ومحتوى مصل الدم، التي يتم تعديلها وفقا للغرض من استزراع والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج والنتائج، بما في ذلك كفاءة التمايز.
تقنيات العزل القائم على علامة:
Cpc يمكن عزل استناداً إلى علامة سطحية محددة تعبير1،2،،من89،10،11،12،13 ،14،،من1516،،من1718. تشير الدراسات السابقة إلى أن ج-كيت والهيئة-1 قد تكون علامات أفضل لعزل المقيم Cpc1،،من1114،،من1920. نظراً لأن أيا من هذه العلامات محددة حقاً لتكلفة النقرة، عادة ما يتم تطبيق تركيبات من علامات مختلفة. على سبيل المثال، حين Cpc التعبير عن مستويات منخفضة من مجموعة ج21، ج-كيت أيضا أعرب عن سائر أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ماست22،23من خلايا بطانية، و الخلايا الجذعية المكونة للدم/السلف24. وهناك مشكلة إضافية هي حقيقة أن ليس كل علامات يتم التعبير عنها عبر جميع الأنواع. وهذا هو الحال بالنسبة للهيئة-1، الذي يعرب بالماوس ولكن ليس في الإنسان25. ولذلك، استخدام البروتوكولات التي تكون مستقلة عن علامات العزلة قد يكون من المفيد النظر إلى التجارب السريرية والدراسات باستخدام عينات بشرية.
تقنيات عزل علامة مستقلة:
وهناك العديد من التقنيات الرئيسية لعزل الحزب الشيوعي الصيني، التي هي أساسا مستقلة للتعبير علامة السطحية، ولكن التي يمكن صقلها بالتحديد على التوالي اﻷفخاذ علامة إيجابية محددة حسب الحاجة (انظر أيضا الجدول 1). (1) تقنية السكان (SP) الجانب اتسم أصلاً في عدد سكان بدائية من الخلايا الجذعية المكونة للدم استناداً إلى القدرة على افلوكس صبغ الحمض النووي هويشت 3334226 ملزم ATP كاسيت (ABC) الناقلين27. تم عزلة بواسطة مجموعات مختلفة القلب SP الخلايا وذكرت للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مع بعض الاختلافات الطفيفة بين التقارير2،8،،من1314. (2) مستعمرة-تشكيل وحدة تنتجها الخلايا الليفية الخلايا (زيمبابوي-خ) أصلاً تم تعريفها على أساس في خلية stromal الوسيطة (MSC)-مثل النمط الظاهري. تستزرع MSCs معزولة عن الأطباق للحث على تشكيل مستعمرة. مثل مستعمرة-تشكيل لجنة السلامة البحرية مثل زيمبابوي-خ يمكن أن تكون معزولة عن قلب الكبار وهي قادرة على تفرق في الأنساب القلب15. (3) المستمدة من كارديوسفيري الخلايا (CDC) هي خلايا مفردة مشتقة من مجموعات من الخلايا التي نمت من خزعات الأنسجة أو اكسبلانتس28،29،،من3031. مؤخرا تبين أن معظمها CD105+/CD90 معارض جزء الخلية/c-kit– –كارديوميوجينيك والتجدد المحتمل32.
هنا، باستخدام SP-Cpc المعزولة من الفئران، نقدم بروتوكول لاستحثاث كفاءة النسب غشائي استناداً إلى دراسة سابقة في Cpc الجرذ والفأر SP-Cpc33. ويتضمن البروتوكول تعديلات محددة للثقافة وأسلوب التوسع فيما يتعلق بكثافة الخلية، ومحتوى مصل المتوسطة، والركيزة. فإنه يمكن تطبيقها ليس فقط على الماوس SP-Cpc ولكن للحصول على أنواع مختلفة من تكلفة النقرة لهذا الغرض لحفز التحول مصير من تضخيم للحزب الشيوعي الصيني غشائي المرتكبة، سواء كان ذلك نظراً لزرع هذه الخلايا أو استعمالها للدراسات الميكانيكية في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا هذا البروتوكول:
يوفر هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لتكلفة النقرة. ووجدنا أن تركيز المصل منخفضة، والخلية منخفضة الكثافة يمكن تحسين كفاءة التمايز بطانية، حيث ثبت LN الركازة أكثر ملاءمة من الجبهة الوطنية في ظل هذه الظروف. استخدمنا نوعين متميزين من تكلفة النقرة: الف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون لورينز فيرا للدعم المفيد الذي قدمته خلال التجارب والموظفين من “مرفق التدفق الخلوي” من إدارة الطب الحيوي (DBM) وجامعة بازل في مستشفى الجامعة. وأيد هذا العمل البقاء في مسار البرنامج من جامعة بازل (موشيزوكي ميتشيكا). م. غابرييلا كوستر معتمد بمنحه من “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” (المنحة رقم 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
