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Developmental Biology

Un ensayo basado en células para investigar la miosina no muscular II contractilidad a través de la gastrulación doblado señalización camino en Drosophila S2R + células

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Aquí describimos un análisis de la contractilidad con Drosophila S2R + células. La aplicación de un ligando exógeno, gastrulación doblado (niebla), conduce a la activación de la contractilidad celular y la vía de señalización de niebla. Este ensayo puede utilizarse para investigar la regulación de las proteínas de la contractilidad celular en la vía de señalización de niebla.

Abstract

Hemos desarrollado un ensayo celular utilizando células de Drosophila que recapitula la constricción apical iniciada por gastrulación doblado (niebla), un morfógeno secretado epitelial. En este ensayo, la niebla se utiliza como un agonista para activar Rho a través de una cascada de señalización que incluye un receptor g-proteína-juntado (niebla), una proteína Gα de12/13 (Concertina/Cta) y que contiene el dominio PDZ Guanina Nucleótido cambio factor (RhoGEF2). Resultados de señalización en la reorganización del citoesqueleto de actina para formar una cadena del monedero contráctil rápida y dramática de la niebla. Niebla soluble es recogido de una línea celular estable y aplicado ectopically S2R + células, conduciendo a cambios morfológicos como la constricción apical, un proceso observado durante procesos de desarrollo como gastrulación. Este ensayo es favorable a la proyección de alto rendimiento y con RNAi, puede facilitar la identificación de genes adicionales implicados en esta vía.

Introduction

Estudios de la embriogénesis conducido organismos modelo genética han sido inestimables para nuestra comprensión de cómo las células se montan en los tejidos. Estudios de la Drosophila melanogaster, en particular, han llevado a la identificación de genes clave y principios biológicos que dirigen la morfogénesis y el desarrollo de los organismos desde la fecundación hasta la edad adulta1,2 , 3. Paralelamente a la investigación genética realizada con Drosophila, líneas de cultivo de células derivadas de tejidos de la mosca de la fruta también han emergido como un poderoso sistema para abordar una amplia gama de molecular y biológico celular preguntas4, 5 , 6. las células de cultivo tisular de drosophila tienen mínimos requisitos de mantenimiento, ya que son cultivados a temperatura ambiente y sin CO2. Como tal, son susceptibles de proyección de imagen de alta resolución, y tienen un alto grado de susceptibilidad a la inhibición de genes de ARNi6,7. Muchos grupos han utilizado las células de cultivo tisular de Drosophila como una herramienta para descubrir genes implicados en la definición de forma de la célula, citoesqueleto dinámica, viabilidad, fagocitosis y señal transduction pathways4,8, 9,10,11. Cuando se empleó como modelo junto con el animal entero, líneas de células de Drosophila cultivadas ofrecen un conjunto de enfoques muy complementarios que acelerar la identificación de moléculas importantes para el desarrollo y proporcionar un marco en el que se determinar sus funciones mecánicas12. Aquí, describimos un ensayo basado en células para estudiar las vías de señalización que provocan constricción apical mediante la gastrulación doblado (niebla) vía13,14. Este análisis de la contractilidad celular permite a los investigadores a investigar tanto la niebla señalización de vía y los mecanismos moleculares que regulan la contractilidad del músculo no miosina II.

Gastrulación del embrión temprano de Drosophila se ha estudiado durante muchos años como un modelo genético para la morfogénesis epitelial y el celular transición de epitelial a la identidad de células mesenquimales. Uno de los eventos clave de la gastrulación es la morfogénesis de un subconjunto de las células epiteliales a lo largo de la embrionaria línea media ventral desde columnar a piramidal en forma15,16,17,18. Esta forma de la célula simple cambiar resultados en la internalización de las células mesodérmicas presuntos y es conducido por la actividad motora de la miosina no muscular II constricting la actina red16,19,20. Décadas de la investigación genética ha identificado los componentes moleculares de esta vía y se colocan secuencialmente en el siguiente orden: 1) niebla es secretada desde el dominio apical de las células epiteliales en la línea media ventral; 2) niebla se une a los receptores Co g-proteína-juntados, niebla y Smog y señala a través de un heterotriméricas G-proteína compleja que contiene la subunidad Gα de12/13 Concertina (Cta), que es acompañada por el Ric no canónico de GEF-8; 3) Cta activa un factor de intercambio del nucleótido guanina y RhoGEF2, que a su vez activa la pequeña proteína G Rho1; 4) Rho1 activa Rho cinasa (Rok); 5) Rok activa contractilidad II de miosina no muscular en el dominio apical mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora (RLC), así produciendo constricción apical (figura 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutaciones en varios de estos componentes interfieran el gastrulation normal y otros movimientos morfogenéticos, incluyendo la formación del disco de ala y las glándulas salivales, lo que indica que esta vía se utiliza en varias etapas de Drosophila embriogénesis de31,de30,32. El camino de la niebla es uno de los modelos mejor estudiados para formar epitelio y ha proporcionado penetraciones importantes en cómo a nivel de tejido morfogénesis es regulado de transcripción genética, basada en el citoesqueleto de la célula movimientos14,15 ,21.

Hemos desarrollado un análisis de la contractilidad celular que recoge muchas de las respuestas celulares aguas abajo de la niebla que se han observado en el desarrollo de embriones de mosca17. Hemos diseñado un S2 estable línea celular que expresa la niebla con la etiqueta en su c-terminal con myc bajo el control de un promotor inducible metallothionine que puede ser cosechado en la adición de sulfato de cobre (CuSO4) al medio. Cuando los medios condicionados de niebla ectópicamente a receptores S2 + (S2R +) las células, que son una sublínea de S2 células distinguidas por su expresión diferencial de receptores como subunidades freido y integrin, las células experimentan una reorganización de la citoesqueleto de constricción apical12,17,27,33. Estos cambios se pueden observar por microscopía de contraste de fase en que niebla tratamiento conduce a la aparición de volantes de fase oscura indicativas de un aumento del radial en la contractilidad del músculo no miosina II, o por microscopía de fluorescencia donde niebla tratamiento conduce a la formación de la miosina no muscular II anillos en las células que expresan EGFP-tagged RLC34. Estos anillos contienen una cadena ligera reguladora miosina fosforilada (pRLC) visible mediante inmunotinción23,34,35. Esta respuesta inducida por la niebla requiere Cta, RhoGEF2, Rho y Rok; así, usando recombinante niebla-Myc y S2R + células, hemos establecido a fin de investigar la constricción inducida por la niebla en un sistema basado en la cultura de tejido24,25,34.

Protocol

1. mantenimiento de las células de cultivo tisular de Drosophila Mantener la S2R + S2R +: RLC-EGFP y S2:Fog-células Myc a temperatura ambiente, preferentemente entre los 20 ° C y 25 ° C, en escudo y cantó M3 insectos suplementado con suero bovino fetal 10%, 100 unidades/mL de penicilina, 100 estreptomicina μg/mL y 0,25 la anfotericina B en un densidad no inferior a 5 x 105 células/mL.Nota: Menores densidades de células conducen a la muerte. Rápidamente descongelar crio-preservado viales de células y transferirlos a un matraz de cultivo de tejidos. Comience con un matraz pequeño cultivo de tejidos (12,5 cm2 o 25 cm2) en un volumen de 4 a 5 mL de medio de cultivo celular hasta que se establece la cultura y han disminuido los signos de muerte celular debido a la descongelación.Nota: Signos de muerte celular debido a la descongelación incluyen células no adherente que carecen de una forma suave, redondeada y pequeños pedacitos oscuros de detritos celulares en el indicativo de medio de cultivo tisular de células necróticas. Poco a poco escalar el tamaño de la cultura del tejido permitiendo que las células a crecer tranquilo durante varios días (4-8 d) para 100% de confluencia, donde no hay poco o ningún espacio entre las células y comienzan a acumularse el uno del otro. Transferencia de todas las células de este 100% confluente más pequeño 12,5 cm2 o 25 cm2 matraz a un matraz de cultivo de tejidos más grande (de 75 cm2) suplementado con 10 mL de medio de cultivo celular.Nota: Mantener las células en un frasco de 75 cm2 producirá suficientes células para la mayoría de los experimentos. Las células de paso cada 3-4 d transfiriendo el medio de cultivo celular hacia arriba y hacia abajo, utilizando para desalojar cualquier libremente adherido a las células de cultivo de tejidos de plástico. La transferencia de este medio, que ahora contiene las células resuspendidas en un frasco de dulce. Diluir 1:4 células con medio de cultivo celular fresco con cada paso y repetir según sea necesario. 2. ARNi tratamiento de células de Drosophila S2R + Nota: Refiérase a Rogers y Rogers6 para instrucciones detalladas sobre cómo producir dsRNA conveniente para el insecto. Transferencia de células S2R + a una placa de cultivo de tejidos bien 6 o 12-bien a una densidad propicia para la viabilidad, no inferior de 5 x 105 células/mL, utilizando completo escudo y cantó M3 medios de cultivo para RNAi tratamientos de la célula. Trabajar en una campana de cultivo de tejidos, eliminar el medio de cultivo celular viejo suavemente inclinando la placa de la pozo de 6 o 12-bien cultivo de tejidos y el medio de cultivo celular con una pipeta de aspiración. Reemplazar rápidamente este viejo medio de cultivo celular con 1 mL de medio de cultivo celular fresco mediante pipeteo en cada pozo.Nota: Esto puede hacerse sin pérdida sustancial después de que las células han podido adherirse libremente durante 30-45 min antes de cambiar el medio de cultivo celular. Añadir 10 μg/mL de dsRNA que se ha generado tras el protocolo detallado en Rogers y Rogers6 transfiriendo directamente en el medio de cultivo de tejidos de cada pozo de células por condición de RNAi. Repita este procedimiento diariamente, sustituir el medio de cultivo celular con 1 mL de medio fresco y 10 μg/mL de dsRNA por condición de RNAi.Nota: Experimentos de RNAi son típicamente realizados por 7 d; sin embargo, el tiempo exacto depende de volumen de ventas de la proteína y la eficacia de lo dsRNA. Arni tratamientos tan cortos como 3 d efectivamente agotan las células de ciertas proteínas, mientras que otros objetivos requieren de tratamientos más6. 3. producción y cosecha de la niebla Aumentar el crecimiento de la S2:Fog-células de Myc, permitiéndoles crecer para d 4-8 obtener un casi 100% confluente 75 cm2 matraz de células en 10 mL de medio de cultivo de células (o alternativamente, un matraz de 150 cm2 en 20 mL de medio de cultivo celular) a maxi minimizar la producción de niebla. Añadir 50 μl de 100 mM CuSO4 (o 100 μl de CuSO4 de 100 mM para un matraz de 150 cm2 ) en el matraz casi 100% confluente 75 cm2 para la inducción del promotor metallothionine. Incubar durante 48 h a temperatura ambiente. Retire el medio de la niebla-Myc-que contienen del frasco de cultivo de tejidos mediante pipeteo y transferirlo a un tubo cónico de 15 mL o 50 mL. Centrifugar a 2.500 x g a 4 ° C durante 10-15 min eliminar el medio de las células y detritos celulares. El medio celular autorizado la transferencia a un nuevo tubo cónico y mantenerlo en hielo. Trabajar en lotes, transfiera 5 mL del medio despejado a 15 mL de los concentradores de 3.000 MW con membranas de celulosa regenerada y centrifugue a 2.500 x g a 4 ° C durante 30 minutos a la vez, para concentrar el medio.Nota: Como alternativa, un concentrador con una mayor capacidad de volumen podría ser utilizado (50 mL). Durante la concentración, un medio de color más oscuro, que se enriquece con niebla, comenzará a construir en la parte inferior del filtro en forma de V. Inserte la punta de la pipeta hasta el fondo de la «V» de la concentradora y retirar los medios de color más oscuro entre cada ronda de la centrifugación y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL fresco. Mantener los medios de comunicación en el hielo. Utilizando el mismo concentrador, repita los pasos 3.4 y 3.5 quitando el color más oscuro concentraron medios de niebla-Myc y reemplazar con más medio precleared, hasta que el medio ha concentrado a 1/10 de su volumen original(es decir, 1 mL de 10 mL de material de partida). Almacenar el concentrado niebla-Myc a 4 ° C.Nota: Después de almacenaje, asegúrese de monitorear la contaminación bacteriana, que puede ser resultado de largos períodos de almacenamiento. Realizar SDS-PAGE al mezclar 10 μl de medio de niebla-Myc concentrado con 10 μl de un buffer que contiene SDS desnaturalización para formar un lisado. Correr el gel SDS-PAGE 35 mA para aproximadamente 1 h. transferir el gel a una membrana de nitrocelulosa (o alternativamente, una membrana PVDF) por 1 h a 120 mA. Realizar un western blot usando cualquier anticuerpo de Myc disponible comercialmente para detectar una banda de 150 kDa.Nota: Puede variar la concentración de niebla-Myc en el medio condicionado por lote. No es necesario determinar la concentración exacta de niebla-Myc para realizar el ensayo, pero la eficacia de cada lote debe ser probada antes de realizar un experimento. Siguientes pasos 3.1-3.2, preparan el control media S2-condicionada por recoger 10 mL de medio de cultivo celular de un frasco casi 100% confluente 75 cm2 de células S2 (o, alternativamente, 20 mL de un frasco de 150 cm2 ) mediante pipeteo. Transferir el control de medio de cultivo celular de S2 a un fresco tubo cónico de 15 mL o 50 mL. Siguientes pasos 3.4-3.7, claro el lisado de las células y desechos celulares por centrifugación (a 2.500 x g a 4 ° C durante 30 min a una hora) transferir el lisado despejado de la célula a concentradores y para concentrar el medio de control en lotes de centrífuga 1/10 del volumen original.Nota: Aplicación de los medios condicionados de S2 no conduce a la contractilidad de células en el ensayo. Almacenar los concentrados medios de control de S2 a 4 ° C durante varios meses.Nota: Después de almacenaje, asegúrese de monitorear la contaminación. 4. preparación de concanavalina-A-revestida platos con fondo de cristal y la chapa de S2R + células Tomar 10 mL de la concanavilina A (estafa A) solución disolviendo 5 mg de estafa A en 10 mL de agua para una concentración final de 0,5 mg/mL. Alícuota esta solución en volúmenes más convenientes (500 μl a 1 mL) y almacenar a-20 ° C. Preparar platos con fondo de cristal de 35 mm por la parte de vidrio de cada plato con 200 μL de la solución de la estafa A la capa e incubar los platos para unos 2 min a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos. A continuación, quite todos la con una solución (que puede ser conservada y reutilizada para futuros experimentos) y deje que los platos, secar al aire completamente.Notas: Platos se pueden preparar en grandes lotes y pueden almacenarse por hasta 6 meses en un lugar seco como un cajón de banco de laboratorio. Añadir aproximadamente 2 mL de medio de cultivo celular fresco a cada plato con fondo de cristal. Resuspender las células S2R + a probar por el análisis por el medio de cultivo celular hacia arriba y hacia abajo, utilizando para separar las células adherentes libremente el pipeteo. Transferencia resuspendidos S2R + células a los platos de 35 mm con fondo de cristal que contiene el medio de cultivo de células frescas por lo que son entre 50% – 70% confluente. Comprobar la densidad de células bajo el microscopio tejido concentrándose hacia arriba y hacia abajo a través de varios campos de las células suspendidas en el medio de obtener una estimación del número de células.Nota: A través de ensayo y error, puede lograrse la densidad adecuada de células necesarias para lograr la confluencia de 50-70%. Permitir a las células fijar a los platos con fondo de cristal recubierto de A con 45-60 minutos.Nota: Adjunto completamente S2R + células aparecen ‘frito-huevo-como,’ aplanado y fase oscura. 5. eficacia prueba del medio condicionado de niebla y el análisis de la contractilidad celular Si lo desea, confirme la producción de niebla-Myc producida y concentrada de la S2:Fog-estable de Myc células líneas por SDS-PAGE y western blot. Añadir 10 μl de tampón de muestra que contienen SDS a 10 μl del concentrado niebla-Myc y hervir por 5 min seguir el estándar SDS-PAGE y western blot protocolos blot para que anti-Myc confirmar la producción de niebla-Myc. Quite el escudo y cantó M3 medio adjunto S2R + células de paso 4.3 transfiriendo suavemente y agregue cuidadosamente la espalda 75 μl de medio escudo y Sang fresco para limitar la cantidad de medio condicionado de niebla utilizado. Añadir 75 μl de medios condicionados de niebla a la porción del vidrio del plato con fondo de cristal de paso 5.2 para llevar el volumen total a 150 μL, en una proporción de 1:1 de niebla-condicionada al escudo y cantó M3.Nota: Es necesario un volumen total de 150-200 μL para cubrir completamente la parte de vidrio de un plato con fondo de cristal; sin embargo, esto dependerá de las dimensiones del plato con fondo de vidrio utilizado. Controlar la contractilidad de las células por microscopía de contraste de fase utilizando 20 X o 40 aumentos observar un campo entero de las células. La morfología de las células de la pista y buscar el patrón de alternancia de fase oscura y fase luz fruncido indicativo del cambio de forma.Nota: La aplicación de niebla lleva típicamente 30% – 50% de las células de S2R + sometidos a constricción celular, y después de 10 minutos, las células comienzan a relajarse, volver a su morfología con bordes lisos, forma de huevo frito. Supervisar la robustez de la contractilidad celular. Si la respuesta de la célula es muy fuerte, con una proporción de 1:1 de medio condicionado de niebla a medio fresco de escudo y Sang, reducir la cantidad de medio condicionado de niebla para conservar el medio concentrado de niebla-Myc para experimentos futuros. Usar sin diluir medio acondicionado niebla si una proporción de 1:1 no conduce a la constricción celular robusto; por lo general, una relación de 1:3 produce suficiente respuesta con éxito para llevar a cabo el experimento.Nota: Una vez establecida la relación adecuada de medio condicionado de niebla a medio fresco de escudo y Sang por dado por lotes de medio condicionado de niebla, utilizar esta relación para todos los otros experimentos. Observar dinámica II de miosina no musculares durante el ensayo de la contractilidad celular utilizando la estable S2R + línea celular que expresa la cadena ligera reguladora etiquetadas de GFP (S2R +: Sqh-EGFP). Utilizando la relación establecida de medio condicionado de niebla a medio fresco de escudo y cantó M3 de pasos 5.2-5.5, eliminar el medio de cultivo celular con una pipeta y añadir medio escudo y Sang volver fresco en la parte de vidrio del plato con fondo de cristal. Perfusión de medio condicionado de niebla en la proporción predeterminada mientras adquiere una secuencia de imágenes de las células vivas; Tenga cuidado para no mover el plato con fondo de cristal durante la perfusión. 6. fijación y tinción de las células estrechas S2R + Fijar las células S2R + usando una solución de paraformaldehído al 10% en buffer PEM (tuberías de 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6.9).Nota: Almacenador intermediario de la PEM se hace típicamente en 2 x solución y puede almacenarse durante meses a 4 ° C. Retire el medio de cultivo celular de células tratadas con niebla S2R + mediante pipeteo y reemplace inmediatamente con 1.5-2.0 mL de solución de paraformaldehído al 10%. Incubar por 15 min a temperatura ambiente.Nota: Células fijas pueden almacenarse en la solución de fijación a 4 ° C por varios días; sin embargo, es importante que se realiza la fijación inicial de 15 minutos a temperatura ambiente antes de transferir las células a 4 ° C. Retirar la solución de paraformaldehído al 10% mediante pipeteo y deshágase apropiadamente de este residuo orgánico. Enjuague las células mediante pipeteo suave 1.5-2.0 mL de solución salina con tampón fosfato (PBS) al plato con fondo de cristal de 35 mm. Quite el viejo PBS mediante pipeteo y sustituirla por 1.5-2.0 mL de PBS fresco 2 x más para eliminar la solución de fijación residual.Nota: Es importante que las células no sequen hacia fuera desde este punto en el protocolo. Bloquear las células con aproximadamente 200 μL de suero de cabra normal 5% diluido en PBS que se ha complementado con 0,1% detergente no iónico (SAFT) por 20 min a temperatura ambiente.Nota: Por lo general, soluciones de bloqueo contienen suero que coincide con el organismo en que los anticuerpos secundarios se plantean. Preparar la solución de anticuerpo primario diluyendo en SAFT. Utilizar un volumen de aproximadamente 200 μL para cubrir completamente la parte de vidrio del plato con fondo de cristal. Eliminar la solución de bloqueo mediante pipeteo y agregue la solución de anticuerpo primario directamente a la parte de vidrio del plato. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente o, alternativamente, incubar durante una noche a 4 ° C. Cuando la incubación durante la noche a 4 ° C, envolver el plato con fondo de cristal de 35 mm con parafilm para evitar la evaporación. Retirar la solución de anticuerpo primario mediante pipeteo y enjuague las celdas por pipeteo 1.5-2.0 mL de PBS fresco en el plato con fondo de cristal de 35 mm. Quitar PBS mediante pipeteo y sustituirla por 1.5-2.0 mL de PBS fresco 2 x más. Preparar una solución de anticuerpo secundario diluyendo en SAFT. Un volumen de 200 μL es suficiente para cubrir sólo la parte de vidrio del plato. Agregue la solución de anticuerpo secundario directamente en la parte de vidrio del plato. Incubar las células con solución de anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Envolver el plato de 35 mm con parafilm si incubar durante la noche, para evitar la evaporación. Retirar la solución de anticuerpo secundario mediante pipeteo y enjuague las células con PBS por pipeteo 1.5-2.0 mL de PBS fresco al plato. Quitar el viejo PBS y poner 2 x más, siguiendo este mismo procedimiento. Preservar las células fijas y teñidas mediante la adición de suficiente un tratamiento anti fluorescente de medio de montaje para cubrir la porción de cristal de la placa de 35mm con fondo de cristal. Almacenar las muestras a 4 ° C y lejos de la luz.Nota: La señal fluorescente se desvanecerán lentamente durante meses incluso si se almacena correctamente. Para mejores resultados, imagen dentro de una semana. 7. la proyección de imagen y cuantificación de la contractilidad celular ensayo Imagen fijada S2R + células usando un estándar invertido microscopio óptico con contraste de fases, DIC o las capacidades de la proyección de imagen de la fluorescencia. Con 20 X o 40 aumentos, captura de 10-30 imagen define campos de células dependiendo de la densidad celular, con el objetivo de adquirir las imágenes de 200 o más células por condición. Utilizando un contador de célula estándar, cuente y anote el número de contratados (fase oscura, pasaban las células) y células noncontracted por cada campo de captura.Nota: Es mejor que dos investigadores llevar cuentas independientes de las células noncontracted y contratadas por campo, o alternativamente, el mismo investigador puede contar el mismo campo de la imagen de las células de tres veces, teniendo en cuenta un número promedio de contratados y noncontracted células por campo a calcular. Preparar varios platos de con fondo de cristal con A recubierto por condición experimental como se describe en el paso 4.2. Pipetear arriba y abajo del medio de cultivo celular para desalojar cualquier adherentes libremente células S2R +: Sqh-EGFP y les de la placa por lo que son 50% – 70% confluente en los platos de 35 mm con fondo de cristal. Permitir a las células a conectar durante 30-45 minutos. Imagen la S2R +: Sqh-EGFP células vivas utilice un microscopio confocal-discos, campo de barrido o por microscopia de luz-hoja 60 X – 100 aumentos. Quitar el escudo y cantó M3 medio del plato con fondo de cristal que contiene células de S2R +: Sqh-EGFP adjuntadas. Inundar la proporción predeterminada de medio condicionado de niebla-Myc a medio fresco de escudo y cantó M3 de pasos 5.2-5.5 directamente sobre la parte de vidrio del plato con fondo de cristal utilizando una pipeta, cuidadosa como para no perturbar la posición del plato en el objetivo. Adquirir imágenes de 12-15 minutos para capturar la iniciación y la contracción completa de las células de S2R +: Sqh-EGFP.Nota: Si la coloración de la miosina no muscular o miosina-pRLC, la formación de un anillo apretado de la miosina en la superficie de las células es también indicativa de la contractilidad. Si imagen células S2R +: Sqh-EGFP vivas, el RLC tagged EGFP formará similar apretados anillos (véase figura 3) indicativo de la contractilidad. El cambio de forma que se produce hará que las células “capó”, ocupando de forma 3D; el plano de enfoque del microscopio puede necesitar ser ajustado para el seguimiento de este cambio de forma de la célula. Bajo control condiciones de ARNi, por lo general, 30% – 50% de las células sufren constricción sobre la adición de la niebla. Tenga en cuenta que algunas condiciones de RNAi pueden producir constricción en la ausencia de niebla.

Representative Results

S2 y S2:Fog-Myc células crecieron a cerca de condiciones confluentes en un matraz de cultivo de tejido de 150 cm2 y fueron tratadas con 25-75 μm CuSO4 durante un periodo de 24-48 horas para inducir la expresión de niebla-Myc (figura 2). Muestras de células de S2 (figura 2A) y S2:Fog-se retiraron células Myc (figura 2B) y producción de niebla-Myc fue supervisado por western blot. Como era de esperar, no pudimos detectar niebla-Myc en los medios de comunicación de células S2 bajo cualquier condición. Sin embargo, detectamos niebla en medio de la S2:Fog-línea de Myc celular estable tan pronto como 24 horas después de la inducción con 75 μm CuSO4. Células de S2R + a con A recubierto con fondo de cristal platos expresando una etiquetado EGFP regulador cadena ligera (GFP-RLC) de la miosina no muscular II (figuras 3A y 3B). Proyección de imagen de células vivas se realizó en un microscopio invertido, dotado de 100 X / 1.4 NA objetivo durante la perfusión de medios condicionados de niebla. Aproximadamente 5 minutos después del tratamiento con niebla-Myc, el RLC formado anillos de constricción II de miosina no muscular. Estos anillos pueden observarse a través de immunostaining S2R + células con un anticuerpo contra un fosfopéptidos sintético correspondiente a residuos que rodean Ser19 de miosina humana RLC (figuras 4A y 4B). Este anticuerpo cross-reacts con Drosophila RLC. Aquí tenemos un ejemplo representativo del análisis de la contractilidad celular siguiendo un tratamiento de 7 días de células con control ARNi y dsRNA contra Rho1 (figuras 5A – 5E). S2R + células fueron plateadas con-A-revestida con fondo de cristal platos y tratados con niebla-condicionada (+ niebla) los medios de comunicación o medios de control (-niebla). Luego se cuantificó el número de células contratados después de la fijación. El indicativo de fase densa volantes de constricción era prominente en las células control agotado tratadas con medios condicionados de niebla (figura 5B). En la figura 5C, Rho-agotado las células tratadas con medio S2-condicionados son un ejemplo típico de la morfología con bordes lisos, forma de huevo frito. Tenga en cuenta que Rho juega un papel en la vía de señalización de niebla, así como en la citocinesis; así, las células Rho-agotado a menudo no se divide correctamente, provocando un aumento en el tamaño celular y ploidía. Tratamiento de control de las células agotadas con medios condicionados de niebla típicas lleva a 30% – 50% de las células que experimentan la constricción, considerando que no pudimos observar la constricción importante en células Rho-agotado. Figura 1:la supuesta niebla señalización vía. En la ausencia de niebla, la subunidad Gα de12/13 , Concertina (Cta), junto con sus socios de la Unión Gϒ y Gβ, son inactivos y asociada a los receptores de la niebla y Smog. Ric-8 Cta de chaperonas y regula su localización subcelular. Sobre niebla vinculante, Cta disassociates de Gϒ y Gβ reclutas RhoGEF2 a la membrana celular que cataliza el intercambio del PIB para el GTP en el GTPase Rho1 pequeño. Rho1 GTP-limite, ahora activa, activa Rho cinasa (Rok), que fosforila el RLC de la miosina no muscular, llevando a su activación y la contractilidad celular subsecuente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Tiempo-curso de producción de niebla-Myc. Estos paneles muestran el medio de cultivo celular de un frasco confluente cerca de 100% de las células del control S2 (A) o (B) S2:Fog-células estables Myc. Las células fueron tratadas con 25-75 μm CuSO4 durante un periodo de 24-48 horas. El medio de cultivo celular fue recogido y preparado para SDS-PAGE y western blot. Niebla-Myc fue detectado por un anticuerpo anti-Myc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Proyección de imagen de células vivas de la constricción inducida por la niebla. Estable S2R + líneas celulares que expresan EGFP-tagged RLC de la miosina no muscular II fue reflejada por microscopía confocal de barrido de campo durante la perfusión de medios condicionados de niebla. Tiempo se muestra en minutos y segundos. (A) este panel muestra una imagen de un plano focal cerca de la interfaz del celular-cubreobjetos en el tiempo 0:00 antes de la perfusión de niebla-Myc. (B) este panel muestra una serie de tiempo (0:30-10:00) de imágenes tomadas en un plano focal en la parte superior de la célula. Las flechas blancas indican la reorganización de la miosina no muscular II según lo indicado por EGFP-RLC en anillos contráctiles durante la constricción. La barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : RLC fosforilada se localiza a anillos contráctiles por inducción de constricción de niebla-Myc. S2R + células eran fijos y manchadas de actina mediante phalloidin (rojo), fosforilada RLC usando un anticuerpo de la fosfoserina 19 (verde) y DAPI (DNA, azul), después del tratamiento con (A) o (B) medios de niebla-Myc-condicionada. Tenga en cuenta la reorganización del RLC fosforilada en aros sobre la adición de la niebla-Myc. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Representante de cuantificación del ensayo contractilidad celular inducida por la niebla. S2R + las células trataron con control (A y B) ARNi o dsRNA (C y D) contra el GTPase Rho1 pequeño durante 7 días. Después de este tiempo, las células fueron plateadas con-A-revestida con fondo de cristal platos y trataron con los medios de control (A y C) o medios (B y D) niebla-Myc-condicionada. La escala de la barra representa 10 μm. (E) A diagrama de dispersión indica las media y el 95% intervalos de confianza de la fracción de células contratadas por condición. Los puntos individuales representan la fracción de células contratadas por campo de visión con 40 aumentos (10-120 células por campo) y los números entre paréntesis indican que el número total de células contado por células contratadas y no contratadas se separa en tres Experimentos de RNAi. Asteriscos denotan una diferencia estadísticamente significativa entre tratados de RNAi y de niebla condiciones según lo determinado por ANOVA de una vía (p < 0.0001) con análisis de post hoc de comparación múltiple de Tukey. Tenga en cuenta que no hubo diferencias estadísticamente significativas (n.s.) entre tratados con ARNi Rho1 muestras tratadas con control o con niebla-Myc-condicionado de los medios de comunicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo detallado para un análisis de la contractilidad celular utilizando una línea de celular del cultivo de tejidos Drosophila (S2R + células), que se somete constricción II de miosina no musculares como respuesta a niebla de señalización. Este análisis es útil para investigar el camino de la niebla, así como mecanismos que regulan la contractilidad del músculo no miosina II.

Consideraciones del cultivo celular:
Las condiciones bajo cuales S2R + se mantienen las células es fundamental para lograr datos confiables de este ensayo. Al momento de realizar el análisis de la contractilidad, lo mejor mantener las células S2R + en escudo y cantó M3 medio insectos. Mientras que las células S2R + pueden prosperar en otros medios de cultivo de células de insecto (por ejemplo, medio insectos SF900 o Schneider), a menudo pierden su capacidad de respuesta a la niebla. S2R + células que tienen un número de paso alta, generalmente más de 20-25 pasajes, empiezan a perder sensibilidad a ARNi. Es mejor usar células de paso temprano para todos los experimentos. Otro aspecto importante a los experimentos de RNAi agotamiento es escoger los controles adecuados. Controles negativos comunes incluyen dsRNA dirigido a EGFP o pBlueScript, ni de que tienen homología con el genoma de la mosca. Dirigidos a las proteínas en el camino de la niebla (Rho, Rok, etc.), que, cuando agota, evitar la activación de la contractilidad de la miosina no muscular, son también útiles controles. S2:Fog-células Myc pueden mantenerse en un medio de cultivo celular alternativo como SF900 complementado con 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 en μg/mL, y 0.25 anfotericina B. Nota que FBS es no requiere cultivo de células en SF900. Densidad celular también es un componente crítico para todos los aspectos de las células de cultivo tisular de Drosophila . A diferencia de las células de cultivo de tejidos de mamíferos, Drosophila-cultivo de tejidos derivados de células prosperan mejor bajo mayores densidades de células (densidad no inferior a 5 x 105 células/mL). Sin embargo, al realizar este análisis, es fundamental que las células no se platean con-A-revestida con fondo de cristal platos por encima de 80% de confluencia, como la cuantificación de los contratados y no contratados células será extremadamente tediosa.

Aspectos críticos y alternativas de la prueba de la contractilidad celular:
La producción de niebla, el ligando que desencadena la contractilidad de la miosina no muscular II, es un componente clave de este ensayo. El niebla gen codifica una proteína de 730 aminoácidos con un peso molecular predicho de ~ 78 kDa26. Análisis de la hidropatía reveló un tramo de 12 residuos hidrofóbicos en el amino-terminus que podría funcionar como una secuencia de la señal de secreción de niebla. Además, la secuencia de codificación también contiene múltiples sitios de glicosilación potenciales N – y O-linked, sugiriendo además que la niebla es una proteína secretada26. En apoyo de esto, niebla fue localizada en vesículas secretoras en células epidérmicas presuntos sometidos a constricción apical16. Expresión de niebla-Myc fue inducida con adición de sulfato de cobre al medio, y anticuerpos contra niebla o Myc reconocieron una proteína de 150 kD de medio de cultivo cosechado de cultivos inducidos pero no de la inducida por los medios de comunicación de las células S2 falta la construcción de la niebla-Myc. Este peso molecular fue más alto que el predicho peso molecular de 80 kD de la niebla y sugiere que la maquinaria secretora de las células S2 puede glycosylate la proteína antes de la exocitosis. Debido a la variabilidad potencial en la purificación de la niebla, es recomendable utilizar el mismo lote de medios condicionados de niebla para todos los experimentos. Fabricación de grandes lotes de concentrados medios de niebla-Myc ayudará a mantener la consistencia a través de rondas de experimentos.

El éxito de este ensayo depende también con confianza, identificar las células que han sido sometidos a constricción. Mientras que se pueden observar células estrechas por microscopía de fluorescencia, mediante tinción para actina o miosina no muscular II, la forma más segura para identificar y cuantificar células estrechas es mediante contraste de fase o microscopio DIC. Cuenta exacta puede lograrse utilizando 20 X – 40 aumentos en la mayoría de los microscopios ópticos. Aunque el protocolo escrito aquí utiliza platos con fondo de cristal, el ensayo puede realizarse también usando cubreobjetos de vidrio 1.5 estándar revestido con c. La adición de la niebla puede hacer en 35 mm de cultivo de tejidos en un cubreobjetos a parafilm, para limitar la cantidad de niebla utilizada para cada ensayo. La calidad de la fijación es un componente crítico de la prueba, como las células mal fijas pueden llevar a falsos positivos. Utilizando solución de fijación fresco y asegurándose de que las células nunca seco fijadas una vez conducirá a resultados más confiables. Finalmente, es importante contar un gran número de células. Por lo general, sólo el 30% – 50% de tratamiento o control células tratadas con ARNi constricción después de la perfusión de la niebla. Sin embargo, existe un nivel basal de constricción que se produce en las células S2R +, así que un gran número de células es necesario para asegurar que cualquier cambio en la fracción de células estrechas es debido a los tratamientos. Además, el agotamiento de algunas proteínas implicadas en la regulación de la contractilidad de la miosina no muscular II puede producir hiper-contractilidad, incluso en la ausencia de niebla. Los datos presentados aquí son más de 3.600 células que fueron contadas en tres sucesivos tratamientos de RNAi usando el mismo lote de medios condicionados de niebla.

Aplicaciones del análisis de la contractilidad celular:
Este análisis de la contractilidad, cuando está juntado con RNAi, los métodos de detección ofrece un potente sistema para estudiar la señalización de las células, la morfogénesis y la contractilidad celular. Previamente, se ha utilizado para identificar a uno de dos receptores Co de niebla21. Una pantalla específica de 138 G-proteína-juntó los receptores (GPCRs) se agota por RNAi en células de S2R +, y su capacidad para responder a niebla fue analizado como se describe en el protocolo presentado aquí. De los 138 GPCRs, un solo gen previamente desacostumbrada, ahora conocido como niebla, fue descubierto. Más investigación sobre la función de niebla demostró que no sólo era necesaria para la contractilidad celular inducida por la niebla en S2R + células, pero también es esencial para la gastrulación en el desarrollo de Drosophila21. Además, este análisis fue utilizado para demostrar que Ric-8, un GEF no canónico, es también un componente en la niebla señalización vía27. Una serie de experimentos de RNAi de epistasis juntada con el análisis de la contractilidad demostró que Ric-8 interacciona con la subunidad de12/13 de Gα Cta y funciones para localizar dentro de la célula, que es fundamental para la contractilidad celular inducida por la niebla31 .

Cultivo de tejidos de Drosophila es idóneo para principiantes, como las células se mantienen fácilmente a temperatura ambiente, no requieren CO2 o tamponado con medio de cultivo celular y son robustas como se mantienen densidades de cultivo celular adecuado. El análisis de la contractilidad celular fue realizado con éxito por la sección de laboratorio de un curso de biología celular Licenciatura, donde los estudiantes no tenían poca o ninguna experiencia con células de cultivo o microscopia. El análisis de la contractilidad celular presentado aquí representa una herramienta poderosa, basada en la célula que puede ser empleada en el descubrimiento de genes o para interrogar la niebla vía de señalización, nos ayuda a mejor comprender procesos de desarrollo, como la constricción apical y contractilidad de músculo no miosina II, en general.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a miembros del laboratorio de Rogers y el laboratorio de Applewhite, Greta Glover y los estudiantes en el curso de biología celular de Reed College primavera 2018, que han contribuido al desarrollo de este protocolo. Además, los autores desean agradecer a miembros del laboratorio de Ritz para lectura y edición de este manuscrito. Investigación en esta publicación fue apoyada por la National Science Foundation bajo el número de concesión 716964 a D.A.A. y A.R. y el Departamento de Biología de la Universidad de Reed.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
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