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Developmental Biology

Un Cell-based Assay pour étudier la myosine Non musculaire II contractilité via la gastrulation plié voie de signalisation de cellules S2R + Drosophila

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Nous décrivons ici un essai de contractilité S2R + cellules de drosophile . L’application d’un ligand exogène, gastrulation plié (Fog), conduit à l’activation du brouillard contractilité cellulaire et de la voie de signalisation. Ce test peut être utilisé pour étudier la régulation des protéines cellulaires contractilité dans le brouillard, voie de signalisation.

Abstract

Nous avons développé un test d’amplification cellulaire utilisant des cellules de drosophile qui récapitule la constriction apicale initiée par gastrulation pliée (brouillard), un autocatalytiques épithéliales sécrétées. Dans cet essai, brouillard est utilisé comme un agoniste pour activer Rho à travers une cascade de signalisation qui comprend un récepteur couplé aux protéines G (Mist), une protéine de12/13 Gα (Concertina/Cta) et un facteur d’échange du nucléotide des guanine-contenant du domaine PDZ (RhoGEF2). Brouillard entraîne la réorganisation rapide et spectaculaire du cytosquelette d’actine pour former une chaîne sac contractile de signalisation. Brouillard soluble est prélevé une lignée cellulaire stable et appliqué de façon ectopique à cellules S2R +, conduisant à des changements morphologiques comme la constriction apicale, un processus observé au cours du processus de développement comme la gastrulation. Ce dosage est susceptible de criblage à haut débit et, à l’aide d’Arni, peut faciliter l’identification des autres gènes impliqués dans cette voie.

Introduction

Études de l’embryogenèse menées auprès des organismes modèles génétiques sont sont révélés très précieux pour notre compréhension de la façon dont les cellules sont assemblés dans les tissus. En particulier, les études de Drosophila melanogaster, ont abouti à l’identification des gènes clés et principes biologiques qui dirigent la morphogenèse et le développement d’organismes de la fécondation à l’âge adulte1,2 , 3. Parallèlement à la recherche génétique menée avec la drosophile, les lignées de cellules cultivées provenant de tissus de la mouche des fruits sont également apparues comme un puissant système d’aborder un large éventail de moléculaire et biologique de la cellule des questions4, 5 , 6. cellules de culture de tissus de drosophile ont des exigences minimales pour l’entretien, car ils sont cultivés à la température ambiante et sans CO2. Par conséquent, ils sont prêtent à l’imagerie haute résolution, et ils ont un haut degré de sensibilité à l’inhibition du gène par ARNi6,7. De nombreux groupes ont utilisé des cellules de culture de tissus de drosophile comme outil pour découvrir les gènes impliqués dans la définition de la forme des cellules, la dynamique du cytosquelette, viabilité, phagocytose et signal transduction pathways4,8, 9,10,11. Travaillant comme un modèle aux côtés de l’animal entier, lignées de cellules cultivées Drosophila offrent un ensemble d’approches très complémentaires qui accélèrent l’identification de molécules importantes pour la mise au point et fournir un cadre dans lequel déterminer leurs rôles mécaniste12. Nous décrivons ici une analyse axée sur les cellules afin d’étudier les voies de signalisation qui déclenchent la constriction apicale via la gastrulation plié (brouillard) voie13,14. Ce dosage de contractilité basés sur les cellules permet aux chercheurs d’étudier tous les deux le brouillard signalisation voie et les mécanismes moléculaires régulant la contractilité de la myosine non musculaire II.

Gastrulation de l’embryon de drosophile précoce a été étudiée pendant de nombreuses années comme modèle génétique pour la morphogenèse épithéliale et la transition cellulaire épithéliale à l’identité des cellules mésenchymateuses. L’un des principaux événements de la gastrulation est la morphogénèse d’un sous-ensemble de cellules épithéliales le long de la ligne ventrale embryonnaire médiane de colonnes à pyramidal en forme15,16,17,18. Cette forme de la cellule simple changement se traduit par l’internalisation des cellules mésodermiques présomptives et est entraînée par l’activité motrice de la myosine non musculaire II constriction de l’actine réseau16,19,20. Des décennies de recherche génétique a identifié les composants moléculaires de cette voie et les a placés séquentiellement dans l’ordre suivant : 1) brouillard est sécrété par le domaine apical des cellules épithéliales à la ligne médiane ventrale ; 2) brouillard se lie à des récepteurs couplés aux protéines G Co, brume et le brouillard enfumé et signale par un heterotrimeric G-protéine complexe contenant la sous-unité de12/13 Gα Concertina (Cta), qui est chaperonné par le Ric non-canoniques de FEM-8 ; 3) LTC active un facteur d’échange nucléotide guanine, RhoGEF2, qui active à son tour la petite Rho1 protéines G ; 4) Rho1 active Rho kinase (République de Corée) ; 5) Rok active la contractilité de la myosine non musculaire II au niveau du domaine apical par la phosphorylation de la chaîne légère régulatrice (RLC), produisant ainsi la constriction apicale (Figure 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Des mutations dans plusieurs de ces éléments interfèrent avec la gastrulation normale et d’autres mouvements morphogénétiques, y compris la formation du disque de l’aile et les glandes salivaires, indiquant que cette voie est utilisée à différents stades de la drosophile l’embryogenèse30,31,32. La voie de brouillard est un des modèles mieux étudiés pour façonner épithéliales et a fourni des renseignements importants sur la morphogenèse comment au niveau du tissu est régulé de transcription génique à axée sur le cytosquelette cellulaire mouvements14,15 ,,21.

Nous avons développé un test de contractilité basés sur les cellules qui récapitule beaucoup d’entre les réponses cellulaires en aval de brouillard qui ont été observées dans le développement des embryons mouche17. Nous avons conçu un S2 stable lignée cellulaire qui exprime le brouillard marquée dans sa partie C-terminale avec myc sous le contrôle d’un promoteur inductible metallothionine qui peut être récolté lors de l’addition de sulfate de cuivre (CuSO4) au milieu. Lorsque médias conditionné par brouillard est appliqué façon ectopique à S2 récepteurs + (S2R +) des cellules, qui sont une sous-population de cellules S2 distingués par leur expression différentielle des récepteurs tels que les sous-unités Frizzled et intégrine, les cellules subissent une réorganisation de la cytosquelette rappelle fortement la constriction apicale12,17,27,33. Ces changements peuvent être observés en microscopie à contraste de phase dans laquelle brouillard traitement entraîne l’apparition de phase noir volants indicatives d’une augmentation de la radiale dans la contractilité de la myosine non musculaire II, ou en microscopie de fluorescence où traitement anti-buée mène à la formation de la myosine non musculaire II anneaux dans les cellules exprimant EGFP-tag RLC34. Ces anneaux contiennent une chaîne légère régulatrice d’expression-myosine phosphorylée (pRLC) visible via immunostaining23,34,35. Cette réponse induite par le brouillard requis LTC, RhoGEF2, Rho et la République de Corée ; ainsi, à l’aide de recombinants brouillard-Myc et cellules S2R +, nous avons établi un moyen d’enquêter sur la constriction induite par le brouillard dans un système à base de tissu-culture24,25,34.

Protocol

1. entretien des cellules de Culture de tissus de drosophile Maintenir la S2R + S2R + : RLC-EGFP et S2:Fog-cellules de Myc à température ambiante, préférence entre 20 ° C et 25 ° C, dans un milieu insecte bouclier et a chanté M3 additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 amphotéricine B à un densité non inférieur à 5 x 105 cellules/mL.Remarque : Des densités plus faibles de cellule conduisent à la mort. Rapidement décongeler cryoconservés flacons de cellules et de les transférer dans une fiole de culture de tissus. Commencer avec une petite culture de tissu flasque (12,5 cm2 ou 25 cm2) dans un volume de 4 à 5 mL de milieu de culture cellulaire jusqu’à ce que la culture est établie et des signes de mort cellulaire en raison de la fonte se sont apaisées.Remarque : Des signes de mort cellulaire en raison de la fonte comprennent les cellules non adhérentes qui n’ont pas une forme lisse et arrondie et petits forets sombres des débris cellulaires dans l’indicatif moyen de vitroplants de cellules nécrotiques. Lentement l’échelle vers le haut de la taille de la culture de tissu en laissant les cellules de croître non perturbé pendant plusieurs jours (4-8 d) à la confluence de 100 %, où il n’y a peu ou aucun espace entre les cellules et ils commencent à s’accumuler sur l’autre. Transférer toutes les cellules de ce ballon 25 cm2 à 100 % confluentes petits 12,5 cm2 ou dans une fiole de culture tissulaire plus gros (de 75 cm2) additionnée de 10 mL de milieu de culture cellulaire.Remarque : Maintenir les cellules dans une fiole de 75 cm2 permettra d’obtenir suffisamment de cellules pour la plupart des expériences. Le passage des cellules tous les 3-4 jours en pipettant également, le milieu de culture cellulaire haut et bas, l’utiliser pour déloger les cellules plus ou moins collés à la plastique de culture de tissus. Le transfert de ce milieu, maintenant contenant les cellules remises en suspension, dans une fiole de frais. Diluer les cellules 1:4 avec milieu de culture de cellules fraîches avec chaque passage et recommencer si nécessaire. 2. RNAi traitement de Drosophila S2R + cellules Remarque : Reportez-vous à Rogers, Rogers6 pour obtenir des instructions détaillées sur la façon de produire des ARNdb adapté aux insecte culture. S2R + cellules de transfert à une plaque 6 puits ou 12 puits de culture de tissus à une densité propice pour la viabilité, non inférieure à 5 x 105 cellules/mL, à l’aide complète de bouclier et de M3 a chanté cellulaire des milieux de culture pour les traitements de l’ARNi. Travailler sous une hotte de culture tissulaire, retirez l’ancien milieu de culture cellulaire par doucement basculer la plaque 6 puits ou 12 puits de culture de tissus et en aspirant le milieu de culture cellulaire avec une pipette. Rapidement remplacer ce vieux milieu de culture cellulaire avec la 1 mL de milieu de culture de cellules fraîches de pipetage il dans chaque puits.NOTE : Ceci est possible sans perte importante après que les cellules ont été autorisés à adhérer librement pendant 30-45 min avant d’échanger le milieu de culture cellulaire. Ajouter 10 µg/mL de dsRNA qui a été générée en suivant le protocole détaillé de Rogers et Rogers6 par pipetage il directement dans le milieu de culture tissulaire de chaque puits de cellules par ARNi condition. Répétez l’opération tous les jours, remplaçant le milieu de culture cellulaire avec 1 mL de milieu frais et 10 µg/mL de dsRNA par ARNi condition.NOTE : Expériences d’Arni sont généralement effectués pour 7D ; Toutefois, la chronologie exacte dépend de renouvellement des protéines et l’efficacité de l’ARNdb. Arni traitements aussi courtes que 3 d appauvrissent efficacement les cellules de certaines protéines, tandis que les autres cibles ont besoin de traitements plus6. 3. Production et récolte de brouillard Intensifier la croissance de la S2:Fog-cellules de Myc en leur permettant de se développer pendant 4-8 d obtenir une presque 100 % confluentes 75 cm2 fiole de cellules dans 10 mL de cellule milieu de culture (ou, subsidiairement, une fiole de 150 cm2 dans 20 mL de milieu de culture cellulaire) pour maxi MIze production de brouillard. Ajouter 50 µL de 100 mM CuSO4 (ou 100 µL de 100 mM de CuSO4 pour un flacon de 150 cm2 ) dans le ballon de près de 100 % confluentes 75 cm2 pour l’induction du promoteur metallothionine. Incuber pendant 48 h à température ambiante. Retirer le milieu contenant du brouillard-Myc du flacon de culture tissulaire en pipettant également et le transférer dans un tube conique 15 mL ou 50 mL. Centrifuger à 2 500 g à 4 ° C pendant 10-15 min dégager le support des cellules et des débris cellulaires. Transférer le milieu cellulaire déboisées dans un nouveau tube conique et l’entretenir sur la glace. En lots, transvaser 5 mL du milieu dégagé à 15 mL de 3 000 concentrateurs MW avec des membranes de cellulose régénérée et il centrifuger à 2 500 g à 4 ° C pendant 30 min à la fois, de concentrer le milieu.Remarque : Vous pouvez également un concentrateur avec une plus grande capacité de volume pourrait être utilisé (50 mL). Lors de la concentration, un support de couleur plus foncé, qui est enrichi de brouillard, commencera à s’accumuler au fond du filtre en forme de V. Insérer l’embout de la pipette au fond du « V » du concentrateur et retirez le support de couleur plus foncé entre chaque tour de centrifugation et transférez-la sur un tube à centrifuger de 1,7 mL fraîches. Maintenir les médias sur la glace. En utilisant le même concentrateur, répétez les étapes 3.4 et 3.5 en enlevant la couleur plus foncée concentrent médias brouillard-Myc et son remplacement par plus pré-approuvée moyen, jusqu’à ce que le milieu a été concentré à 1/10e de son volume initial (c.-à-d., 1 mL de 10 mL de matériel de départ). Stocker le concentré brouillard-Myc à 4 ° C.Remarque : Après stockage, n’oubliez pas de surveiller la contamination bactérienne, qui peut entraîner de longues périodes de stockage. Effectuer SDS-PAGE en mélangeant 10 µL de milieu de brouillard-Myc concentré à 10 µL d’un tampon contenant du SDS dénaturant pour former un lysat. Exécutez le gel SDS-PAGE à 35 mA pour environ 1 h. transférer le gel dans une membrane de nitrocellulose (ou, subsidiairement, une membrane PVDF) pendant 1 h à 120 mA. Effectuer un transfert western à l’aide de n’importe quel anticorps Myc disponibles dans le commerce pour détecter une bande de 150 kDa.Remarque : La concentration de brouillard-Myc dans le milieu conditionné peut varier par lot. Il n’est pas nécessaire de déterminer la concentration exacte de brouillard-Myc afin d’effectuer le test, mais l’efficacité de chaque lot doit être testée avant d’effectuer une expérience. Étapes suivantes 3.1 ou 3.2, préparent le contrôle média S2-conditionné en recueillant 10 mL de milieu de culture cellulaire d’une fiole de près de 100 % confluentes 75 cm2 de cellules S2 (ou, alternativement, 20 mL, un flacon de 150 cm2 ) de pipetage. Transfert du contrôle de milieu de culture cellulaire S2 à un nouveau tube conique de 15 mL ou 50 mL. Étapes suivantes 3,4 à 3,7, effacer le lysat de cellules et de débris cellulaires par centrifugation (à 2 500 g à 4 ° C pendant 30 min à une heure) et puis transférer la cellule défrichée lysate de concentrateurs et centrifuger afin de concentrer le fluide en lots pour 1/10ème volume original.NOTE : Application des médias conditionné S2 ne conduit pas à la contractilité cellulaire importante dans l’analyse. Stocker les concentré S2 les fluides à 4 ° C pendant plusieurs mois.Remarque : Après stockage, n’oubliez pas de surveiller la contamination. 4. préparation de la concanavaline A enduit les plats à fond de verre et les bordés de cellules S2R + Faire 10 mL de la concanavaline A (con A) solution en dissolvant 5 mg de con A dans 10 mL d’eau pour une concentration finale de 0,5 mg/mL. Aliquote cette solution en volumes plus commodes (500 µL à 1 mL) et les conserver à-20 ° C. Préparer des plats à fond de verre de 35 mm en enduisant la partie verre de chaque plat avec 200 µL de la solution de con A et incuber la vaisselle pendant environ 2 min à température ambiante dans une hotte de culture de tissus. Ensuite, supprimez tous la con une solution (qui peut être conservée et réutilisée pour de futures expériences) et laissez la vaisselle sécher complètement à l’air.NOTES : Plats peuvent être préparés dans des lots importants et peuvent être stockées pendant 6 mois dans un endroit sec comme un tiroir de banc de laboratoire. Ajouter environ 2 mL du milieu de culture de cellules fraîches à chaque plat à fond de verre. Remettre en suspension les cellules S2R + à être testée par le test en pipettant également, le milieu de culture cellulaire haut et en bas, l’utiliser pour détacher les cellules faiblement adhérentes. Transférer les S2R + cellules resuspendues dans les plats de 35 mm à fond de verre contenant le milieu de culture de cellules fraîches afin qu’ils soient entre 50-70 % anastomosé. Vérifiez la densité des cellules au microscope de la culture de tissus en se concentrant en haut et en bas par le biais de plusieurs plaines des cellules en suspension dans le milieu pour obtenir une estimation du nombre de cellules.Remarque : Par tâtonnement, la densité appropriée de cellules nécessaires pour atteindre les 50 % – 70 % confluence est possible. Permettre à des cellules d’attacher aux con-A-enduit à fond de verre plats pendant 45-60 min.NOTE : Cellules S2R + entièrement attachées figurent « frit-semblables à des œufs, » aplatie et phase sombre. 5. efficacité Test du milieu conditionné par brouillard et le dosage de la contractilité cellulaire Si vous le souhaitez, confirmer le rendement de brouillard-Myc produites et concentré à partir de la S2:Fog-stable de Myc cellules lignes par SDS-PAGE et éponger occidental. Ajouter 10 µL de tampon contenant du SDS à 10 µL de concentré de brouillard-Myc et faire bouillir pendant 5 min. suivre le standard SDS-PAGE et western blot protocoles et épongez pour anti-Myc confirmer la production de brouillard-Myc. Retirez les S2R + cellules attachées à l’étape 4.3 moyen tous le bouclier et la M3 a chanté par pipetage doucement et ajouter avec précaution le dos de 75 µL de milieu de bouclier et de Sang frais pour limiter la quantité de brouillard-conditionné support utilisé. Ajouter 75 µL de médias brouillard-conditionné à la partie de verre du verre à fond plat de l’étape 5.2 pour porter le volume total à 150 µL, dans un rapport 1:1 des médias brouillard conditionnée au bouclier et M3 a chanté.Remarque : Un volume total de 150-200 µL est nécessaire pour couvrir entièrement la partie de verre d’un plat typique à fond de verre ; Cependant, cela dépendra de la dimension du plat à fond de verre utilisé. Surveiller la contractilité des cellules en microscopie à contraste de phase en utilisant 20 X ou 40 X grossissement d’observer tout un champ de cellules. Suivre la morphologie des cellules et recherchez le modèle d’alternance de phase sombre et lumière phase ébouriffer le changement de forme de l’indicatif.Remarque : L’application du brouillard mène habituellement à 30 % – 50 % des S2R + cellules subissant une constriction cellulaire, et après 10 min, les cellules commencent à se détendre, de retour à leur morphologie à bords lisses, frits-semblables à des œufs. Surveiller la robustesse de la contractilité cellulaire. Si la réponse des lymphocytes est très forte à l’aide d’un ratio de 1:1 du milieu conditionné par brouillard au milieu du bouclier et de Sang frais, réduire la quantité de brouillard-conditionné moyenne à conserver le milieu de brouillard-Myc concentré pour de futures expériences. Utiliser non dilué moyen de brouillard-conditionné si un ratio de 1:1 n’entraîne pas de constriction cellulaire robuste ; en règle générale, un ratio de 1:3 produit assez réponse à mener à bien l’expérience.Remarque : Une fois le rapport approprié du milieu conditionné par brouillard au milieu du bouclier et de Sang frais établi par compte tenu de la lot du milieu conditionné par brouillard, utilisez ce rapport pour toutes les autres expériences. Surveiller la dynamique de la myosine non musculaire II pendant le test de contractilité cellulaire à l’aide de la stable S2R + lignée cellulaire qui exprime la GFP-étiquetée chaîne légère régulatrice (S2R + : Sqh-EGFP). En utilisant le rapport de milieu conditionné par brouillard milieu frais de bouclier et a chanté M3 d’étapes 5.2-5.5, éliminer le milieu cellulaire-cultivées avec une pipette et ajouter le milieu arrière frais de bouclier et de Sang dans la partie de verre du plat à fond vitré. Perfuse milieu conditionné par brouillard au ratio prédéterminé tout en acquérant une séquence d’images des cellules vivantes ; prendre soin de façon à ne passer pas le plat à fond de verre durant la perfusion. 6. fixation et coloration des cellules resserrée S2R + Difficulté S2R + cellules en utilisant une solution de paraformaldéhyde de 10 % dans un tampon PEM (tuyaux de 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).NOTE : Tampon PEM est généralement faite à 2 x la solution mère et peut être conservée pendant des mois à 4 ° C. Retirer le milieu de culture cellulaire de cellules traitées brouillard S2R + en pipettant également et le remplacer immédiatement par 1,5 à 2,0 mL de la solution de paraformaldéhyde à 10 %. Incuber pendant 15 min à température ambiante.Remarque : Les cellules fixes peuvent être stockés dans une solution de fixation à 4 ° C pendant plusieurs jours ; Cependant, il est important que la fixation initiale de 15 min se fait à température ambiante avant de transférer les cellules à 4 ° C. Enlever la solution de paraformaldéhyde à 10 % de pipetage et éliminer ce déchet organique correctement. Rincer les cellules par pipetage doucement 1,5 à 2,0 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) au 35 mm à fond de verre plat. Enlever le vieux PBS de pipetage et remplacez-le par 1,5 à 2,0 mL de PBS frais 2 x plus d’enlever la solution de fixation résiduelle.Remarque : Il est important que les cellules ne séchez pas partir de ce point sur dans le protocole. Bloquer les cellules avec environ 200 µL de sérum de chèvre normal 5 % dilué dans du PBS qui a été complétée avec 0,1 % de détergent non ionique (PBST) pendant 20 min à température ambiante.Remarque : En règle générale, blocage solutions contiennent sérum qui correspond à l’organisme dans que les anticorps secondaires sont déclenchés. Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant il en PBST. Utiliser un volume d’environ 200 µL pour recouvrir entièrement la partie de verre du verre à fond plat. Enlever la solution de blocage de pipetage et ajoutez la solution de l’anticorps primaire directement à la partie de verre du plat. Incuber pendant 1 heure à température ambiante ou, alternativement, incuber une nuit à 4 ° C. Lors de l’incubation durant la nuit à 4 ° C, enveloppez le plat à fond de verre de 35 mm avec parafilm pour éviter une évaporation. Enlever la solution de l’anticorps primaire de pipetage et rincer les cellules par pipetage 1,5 à 2,0 mL de PBS frais au 35 mm à fond de verre plat. Supprimer les PBS de pipetage et remplacez-le par 1,5 à 2,0 mL de PBS frais 2 x plus. Préparer une solution d’anticorps secondaire il diluer dans du PBST. Un volume de 200 µL est suffisant pour juste couvrir la partie de verre du plat. Ajouter la solution d’anticorps secondaire directement à la prise de verre du plat. Incuber les cellules avec la solution d’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C. Envelopper le plat de 35 mm avec parafilm si incubation pendant la nuit, pour éviter l’évaporation. Enlever la solution de l’anticorps secondaire de pipetage et rincer les cellules avec du PBS de pipetage 1,5 à 2,0 mL de PBS frais au plat. Enlever le vieux PBS et le remplacer 2 fois plus, selon cette même procédure. Préserver les cellules fixes et teintés en ajoutant assez d’un support de montage fluorescent anti-fondu pour couvrir la partie de verre du plat 35mm à fond de verre. Stocker les échantillons à 4 ° C et à l’abri de la lumière.NOTE : Le signal fluorescent décroîtra lentement au cours des mois même si entreposé. Pour de meilleurs résultats, image moins d’une semaine. 7. l’imagerie et la Quantification de l’essai de contractilité cellulaire Image fixé S2R + cellules en utilisant une norme inversée microscope optique à contraste de phase, DIC ou capacités d’imagerie de fluorescence. En utilisant 20 X ou 40 X grossissement, capturer des champs ne se chevauchant pas image 10-30 de cellules selon la densité de la cellule, dans le but d’acquérir des images de 200 ou plus de cellules par condition. À l’aide d’un compteur de cellules standard, compter et enregistrer le numéro de contrats (phase sombre, spaciosités cellules) et différence par chaque champ capturé.Remarque : Il est préférable d’avoir les deux chercheurs à prendre des comtes indépendantes des cellules sous contrats et différence par champ, ou alternativement, le même chercheur peut compter le même champ de l’image des cellules trois fois, permettant un nombre moyen de contrat et différence de cellules par champ calculé. Préparer plusieurs plats à fond de verre con-A-enduit par condition expérimentale comme indiqué au point 4.2. Pipetter dans le milieu de culture cellulaire pour déloger les cellules S2R + : Sqh-EGFP faiblement adhérentes et leur plaque pour qu’ils soient confluente de 50 à 70 % dans les plats à fond de verre de 35 mm. Laissez les cellules attacher pendant 30-45 minutes. Image la S2R + : Sqh-EGFP cellules vivantes à l’aide d’un microscope confocal filature-disque, le champ balayé, ou par microscopie à lumière-feuille 60 X – 100 X grossissement. Enlever tout le bouclier et a chanté M3 moyenne du plat à fond de verre contenant des cellules S2R + : Sqh-EGFP attachées. Perfuse le ratio prédéterminé de brouillard-Myc milieu conditionné milieu frais de bouclier et a chanté M3 d’étapes 5.2-5.5 directement sur la partie de verre du plat à fond de verre à l’aide d’une pipette, attention pour ce qui est à ne pas perturber la position de la capsule sur l’objectif. Acquisition d’images pour les 12-15 min afin de capturer l’initiation et la contraction complète des cellules S2R + : Sqh-EGFP.Remarque : Si la coloration de la myosine non musculaire ou la myosine-pRLC, la formation d’un anneau serré de myosine à la surface des cellules est aussi indicative de la contractilité. Si cellules S2R + : Sqh-EGFP direct, le RLC EGFP-tag formeront similaire serré d’imagerie bagues (voir Figure 3) de l’indicatif de la contractilité. Le changement de forme qui se produit entraîne les cellules de « bonnet », reprenant la forme 3D ; le plan de mise au point du microscope peut devoir être ajustée pour suivre les changements de forme de cette cellule. En vertu de contrôler les conditions de l’ARNi, en général, 30 % – 50 % des cellules subissent une constriction lors de l’addition du brouillard. Sachez que certaines conditions RNAi peuvent entraîner une constriction en l’absence de brouillard.

Representative Results

S2 et S2:Fog-Myc cellules ont été cultivées à proximité des conditions confluentes dans une fiole de vitroplants de 150 cm2 et ont été traités avec 25-75 µM CuSO4 sur une période de 24 à 48 heures pour induire l’expression de brouillard-Myc (Figure 2). Des échantillons de cellules S2 (Figure 2A) et S2:Fog-Myc cellules (Figure 2B) ont été retirées et la production de brouillard-Myc a été suivie par western blot. Comme prévu, nous n’avons pas détecter brouillard-Myc dans les médias récoltées à partir des cellules S2 dans toutes les conditions. Cependant, nous avons détecté brouillard dans les médias récoltées dans le S2:Fog-lignée cellulaire stable de Myc, dès 24 heures après l’induction avec 75 µM CuSO4. S2R + cellules attachés à la con-A-enduit à fond de verre plats exprimant une étiquette EGFP chaîne légère régulatrice (GFP-RLC) de la myosine non musculaire II (Figures 3 a et 3 b). Imagerie de cellules vivantes a été réalisée sur un microscope inversé équipé d’un 100 X / 1.4 NA objectif durant la perfusion de médias conditionné par brouillard. Environ 5 minutes après le traitement avec brouillard-Myc, le RLC formé les anneaux de constriction de la myosine non musculaire II. Ces anneaux peut être observés par immunomarquage S2R + cellules avec un anticorps dirigé contre un phosphopeptide synthétique correspondant à des résidus qui entourent Ser19 de myosine humaine RLC (Figures 4 a et 4 b). Cet anticorps réagissent avec Drosophila RLC. Nous avons ici un exemple représentatif de l’essai de contractilité cellulaire après un traitement de 7 jours de cellules avec contrôle RNAi et dsRNA contre Rho1 (Figures 5 a – 5E). S2R + cellules étaient plaquées sur la con-A-enduit à fond de verre vaisselle et traités avec brouillard conditionnée (+ brouillard) médias ou contrôle (-brouillard). Le nombre de cellules sous contrats ont été quantifié puis après fixation. Les indicatifs de phase dense aux volants de constriction dominait dans les cellules de contrôle appauvri traitées avec brouillard-conditionné médias (Figure 5B). Figure 5C, Rho-appauvri des cellules traitées avec milieu conditionné S2 sont un exemple typique de morphologie à bords lisses, frits-semblables à des œufs. Notez que Rho joue un rôle dans la voie de signalisation de brouillard, ainsi que dans la cytokinèse ; ainsi, Rho-appauvri cellules souvent ne pas diviser correctement, conduisant à une augmentation de la taille des cellules et la ploïdie. Traitement de la commande cellules appauvris avec les médias conditionné par Fog typique conduit à 30-50 % des cellules subissant une constriction, alors que nous n’a pas observé de constriction importante dans les cellules appauvries Rho. Figure 1:le brouillard putatif, voie de signalisation. En l’absence de brouillard, la sous-unité Gα12/13 Concertina (Cta), ainsi que ses partenaires de liaison Gϒ et Gβ, sont inactifs et associé les corécepteurs de brume et le brouillard enfumé. CIR-8 accompagnateurs LTC et régule sa localisation subcellulaire. À brouillard binding, LTC dissocie de Gϒ et Gβ recrute RhoGEF2 à la membrane de la cellule où elle catalyse l’échange du PIB pour GTP dans la petite GTPase Rho1. GTP-bondissent Rho1, maintenant active, active Rho Kinase (République de Corée), qui phosphoryle le RLC de la myosine non musculaire, conduisant à son activation et la contractilité cellulaire ultérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Évolution temporelle de la production de brouillard-Myc. Ces panneaux montrent un milieu de culture cellulaire récolté dans une fiole confluentes proche de 100 % des cellules contrôles S2 (A) ou (B) S2:Fog-cellules stables de Myc. Les cellules ont été traitées avec 25-75 µM CuSO4 sur une période de 24 à 48 heures. Le milieu de culture cellulaire a été recueilli et préparé pour SDS-PAGE et éponger occidental. Brouillard-Myc a été détectée par un anticorps anti-Myc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Imagerie de cellules vivantes de constriction induite par le brouillard. Stable S2R + les lignées de cellules exprimant EGFP-tag RLC de la myosine non musculaire II ont été photographié par microscopie confocale a balayé au cours de la perfusion des médias conditionné par brouillard. Heure est indiquée en minutes et secondes. (A), ce panneau affiche une image d’un plan focal à proximité de l’interface de la cellule-lamelle au temps 0:00 avant la perfusion de brouillard-Dauphiné (B), ce panneau affiche une série temporelle (0:30-10:00) des images prises dans un plan focal près du sommet de la cellule. Les flèches blanches indiquent la réorganisation de la myosine non musculaire II comme indiqué par EGFP-RLC en rondelles contractiles au cours de la constriction. La barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Phosphorylée-RLC se localise à anneaux contractiles après induction de constriction par brouillard-Dauphiné S2R + cellules étaient fixés et colorés pour l’actine en utilisant la phalloïdine (rouge), phosphorylée RLC à l’aide d’un anticorps phosphosérine-19 (vert) et DAPI (ADN, bleu), après traitement avec contrôle de (A) ou (B), brouillard-Myc-conditionné médias. Notez la réorganisation du RLC phosphorylé en rondelles sur l’ajout du brouillard-Dauphiné s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Quantification représentatif de l’essai de contractilité cellulaire induite par le brouillard. S2R + cellules ont été traitées avec contrôle (A et B) Arni ou dsRNA (C et D) contre le petit GTPase Rho1 pendant 7 jours. Après ce temps, les cellules ont été cultivées sur con-A-enduit les plats à fond de verre et ont été traités par les médias de contrôle (A et C) ou des médias à brouillard-Myc-conditionné (B et D). L’échelle bar représente 10 µm. (E) un scatter emplacement indique les intervalles de confiance moyenne et 95 % de la fraction des cellules contractées par l’État. Chaque point représente la fraction de cellules sous contrats / champ de vision au grossissement X 40 (cellules de 10 à 120 par champ) et les chiffres entre parenthèses indiquent que le nombre total de cellules comptées pour cellules sous contrats et sans contrat distinct sur trois Expériences d’Arni. Astérisques indiquent une différence statistiquement significative entre les traités RNAi et brouillard conditions comme déterminé par ANOVA à (p < 0,0001) avec analyse de post hoc à comparaison multiple de Tukey. Notez qu’il n’y avait aucune différence statistiquement significative (n.s.) entre échantillons Rho1 RNAi-traités, traités avec contrôle ou des médias de brouillard-Myc-conditionné. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour un dosage de contractilité basés sur les cellules à l’aide d’une lignée de cellules de culture de tissus de drosophile (cellules S2R +), qui subit une constriction II la myosine non musculaire en réponse à brouillard de signalisation. Ce dosage est utile pour étudier la voie de brouillard, ainsi que les mécanismes qui régulent la contractilité de la myosine non musculaire II.

Culture cellulaire considérations :
Les conditions en vertu de laquelle S2R + cellules sont maintenues est essentielle pour obtenir des données fiables de ce test. Lorsque vous envisagez d’effectuer l’essai de la contractilité, il est préférable de maintenir les cellules S2R + en bouclier et a chanté M3 support d’insectes. Tandis que les cellules S2R + peuvent se développer dans d’autres milieux de culture cellulaire insectes (p. ex., milieu insecte SF900 ou de Schneider), ils perdent souvent leur réactivité au brouillard. S2R + les cellules qui possèdent un nombre élevé de passage, généralement plus de 20-25 passages, commencent à perdre de la sensibilité à l’ARNi. Il est préférable d’utiliser des cellules de rapide-passage pour toutes les expériences. Un autre aspect important à des expériences de déplétion Arni est de choisir des contrôles appropriés. Contrôles négatifs communs incluent dsRNA ciblage EGFP ou pBlueScript, ni de qui ont une homologie avec le génome de la mouche. Ciblage des protéines dans la voie de brouillard (Rho, Rok, etc.), qui, quand épuisée, empêcher l’activation de la contractilité de la myosine non musculaire, sont également des contrôles utiles. S2:Fog-cellules de Myc peuvent être maintenus dans un milieu de culture cellulaire alternatif comme SF900 additionné de 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, et 0,25 amphotéricine B. Notez que BF n’est pas requis lorsque la mise en culture des cellules en SF900. La densité cellulaire est également une composante essentielle pour tous les aspects des cellules de culture de tissus de drosophile . Contrairement aux cellules de culture de tissus chez les mammifères, Drosophila-cellules dérivées des vitroplants prospèrent mieux sous des densités plus élevées de cellule (densités non inférieur à 5 x 105 cellules/mL). Toutefois, lorsque vous effectuez ce test, il est essentiel que les cellules ne sont pas plaqués sur la con-A-enduit de vaisselle à fond de verre au-dessus de 80 % à confluence, car la quantification des contractuels contre les cellules sans contrat deviendra extrêmement fastidieuse.

Aspects critiques et approches de l’analyse de contractilité cellulaire :
La production de brouillard, le ligand qui déclenche la contractilité de la myosine non musculaire II, est un élément clé de ce test. Le brouillard gène code pour une protéine de 730 acides aminés avec un poids moléculaire prévu de ~ 78 kDa26. Hydropathy analyse a révélé un tronçon de 12 résidus hydrophobes à aminée du brouillard qui pourrait fonctionner comme une séquence de signaux de sécrétion. En outre, la séquence codante contient également plusieurs sites à potentiel glycosylation N – et O-liés, plus loin, ce qui suggère que le brouillard est une protéine sécrétée26. À l’appui de cela, brouillard a été localisée à des vésicules de sécrétion dans les cellules épidermiques présomptives subissant la constriction apicale16. Expression de brouillard-Myc a été induite par addition de sulfate de cuivre au milieu, et anticorps anti brouillard ou Myc a reconnu une protéine de 150 kD de milieu de culture récoltée des cultures induits mais pas d’induite par les médias de cellules S2 manque la construction de brouillard-Myc. Ce poids moléculaire était plus élevé que le poids moléculaire de prévu 80-kD de brouillard et suggère que le mécanisme sécrétoire des cellules S2 peut glycosylate la protéine avant l’exocytose. En raison de la variabilité dans la purification de brouillard, il est conseillé d’utiliser le même lot des médias conditionné par brouillard pour toutes les expériences. Constituant des lots importants de médias de brouillard-Myc concentré aidera à maintenir la cohérence de l’ensemble des séries d’expériences.

La réussite de ce test dépend aussi de la confiance identifier les cellules qui ont subi une constriction. Alors que ces cellules peuvent être observés par microscopie de fluorescence, de coloration pour l’actine ou non musculaires myosine II, le moyen le plus fiable pour identifier et quantifier ces cellules est par contraste de phase ou de microscopie DIC. Chefs d’accusation précis peuvent être réalisés à l’aide de 20 X – 40 X grossissement sur la plupart des microscopes légers. Bien que le protocole écrit utilise ici des plats à fond de verre, le test peut également être effectué à l’aide de lamelles de 1,5 verre standard couché avec con A. L’ajout du brouillard peut être fait en 35 mm de culture de tissus sur une lamelle couvre-objet ajouté parafilm, afin de limiter la quantité de brouillard utilisé pour chaque dosage. La qualité de la fixation est un élément essentiel de l’analyse, car les cellules fixes mal peuvent provoquer de faux positifs. À l’aide de la solution de fixation fraîches et en s’assurant que les cellules jamais sec une fois fixées conduira à des résultats plus fiables. Enfin, il est important de compter un grand nombre de cellules. En général, seulement 30 % – 50 % de non traitées, ou le contrôle les cellules traitées Arni se contractent après la perfusion de brouillard. Cependant, il y a un niveau basal de la constriction qui survient chez les cellules S2R +, donc un grand nombre de cellules est nécessaire pour s’assurer que tout changement dans la fraction de ces cellules est due à des traitements. En outre, l’appauvrissement de certaines protéines impliquées dans la régulation de la contractilité de la myosine non musculaire II peut conduire à hyper-contractilité, même en l’absence de brouillard. Les données présentées ici sont de plus de 3 600 cellules comptées dans trois traitements successifs d’Arni à l’aide du même lot de médias conditionné par brouillard.

Applications de l’essai de contractilité cellulaire :
Ce test de contractilité, lorsqu’il est couplé avec RNAi de méthodes, de dépistage offre un système puissant pour étudier la signalisation cellulaire, morphogenèse et contractilité cellulaire. Auparavant, il a été utilisé pour identifier un des deux brouillard corécepteurs21. Un écran ciblé de 138 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est épuisé par ARNi dans les cellules S2R +, et sa capacité à répondre au brouillard a été dosée comme décrit dans le protocole présenté ici. De la 138 RCPG, un seul gène non définie auparavant, maintenant connu comme le brouillard, a été découvert. Enquête plus approfondie sur la fonction de brume ont démontré que non seulement il fallait pour la contractilité cellulaire induite par le brouillard dans les cellules S2R +, mais il est également essentiel pour la gastrulation dans le développement de Drosophila21. En outre, ce test a été utilisé pour démontrer que CIR-8, un FEM non canonique, est également un composant dans le brouillard27de la voie de signalisation. Une série d’expériences d’Arni épistasie couplé avec le test de contractilité a démontré que les CIR-8 interagit avec la sous-unité de12/13 Gα Cta et les fonctions de localiser à l’intérieur de la cellule, ce qui est essentielle à la contractilité cellulaire induite par le brouillard31 .

Culture de tissus de drosophile est bien adaptée aux novices, comme les cellules sont facilement maintenus à température ambiante, ne nécessitent pas de CO2 ou mis en mémoire tampon de milieu de culture cellulaire et sont robustes, aussi longtemps que les densités de culture cellulaire appropriée sont maintenues. Le dosage de la contractilité cellulaire a été effectué avec succès par la section laboratoire d’un cours de biologie de premier cycle cellulaire, où les étudiants n’avaient peu ou aucun expérience avec la culture de cellules ou de microscopie. Le dosage de contractilité cellulaire présenté ici représente un outil puissant, à base de cellules qui peut être employé dans la découverte de gènes, ou pour interroger le brouillard voie de signalisation, nous aidant à mieux comprendre le processus de développement, tels que la constriction apicale et contractilité II la myosine non musculaire, en général.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Rogers et le laboratoire Applewhite, Greta Glover et les étudiants en cours de biologie cellulaire au Reed College printemps 2018, qui ont contribué à l’élaboration du présent protocole. En outre, les auteurs aimeraient remercier les membres du laboratoire du Ritz pour soigneusement la lecture et l’édition de ce manuscrit. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par la National Science Foundation sous attribution numéro 716964 D.A.A. et A.R. et le département de biologie de Reed College.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
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References

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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
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