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Developmental Biology

Um ensaio de baseada em célula para investigar não-músculo Myosin II contratilidade através o dobrado-gastrulação sinalização via em Drosophila S2R + células

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Aqui descrevemos um ensaio de contratilidade usando células de Drosophila S2R +. A aplicação de um ligante exógena, dobrado gastrulação (névoa), leva à ativação do nevoeiro contratilidade celular e via de sinalização. Este ensaio pode ser usado para investigar o Regulamento das proteínas celulares contratilidade no nevoeiro via de sinalização.

Abstract

Nós desenvolvemos um ensaio baseada em célula usando células de Drosophila que recapitula a constrição apical, iniciada pelo dobrado gastrulação (névoa), um morphogen epitelial secretado. Neste ensaio, o nevoeiro é usado como um agonista para ativar Rho através de uma cascata de sinalização que inclui um receptor acoplado à G-proteína (névoa), uma proteína de12/13 Gα (Concertina/Cta) e um domínio PDZ-contendo guanina fator troca do nucleotide (RhoGEF2). Nevoeiro resultados na reorganização rápida e dramática do citoesqueleto de actina para formar uma cadeia de caracteres de bolsa contrátil de sinalização. Nevoeiro solúvel é coletado de uma linha celular estável e aplicado ectopically a S2R + células, levando a alterações morfológicas como constrição apical, um processo observado durante os processos de desenvolvimento, tais como a gastrulação. Este ensaio é passível de rastreio com throughput alto e, usando o RNAi, pode facilitar a identificação de genes adicionais envolvidos nesta via.

Introduction

Estudos da embriogênese realizados com organismos modelo genético provar inestimáveis para a nossa compreensão de como as células são montadas em tecidos. Estudos de Drosophila melanogaster, em particular, levaram à identificação de genes-chave e princípios biológicos que dirigem a morfogênese e desenvolvimento de organismos de fertilização para idade adulta1,2 , 3. em paralelo com a pesquisa genética conduzida com Drosophila, linhas de células cultivadas derivadas de tecidos de mosca de fruta também emergiram como um poderoso sistema para abordar um vasto leque de molecular e biológica de célula perguntas4, 5 , 6. células de cultura de tecidos de drosophila tem requisitos mínimos para a manutenção, como eles são cultivados à temperatura ambiente e sem CO2. Como tal, são passíveis de geração de imagens de alta resolução, e eles têm um alto grau de susceptibilidade à inibição de gene por RNAi6,7. Muitos grupos utilizaram células de cultura de tecidos de drosófila como uma ferramenta para descobrir genes envolvidos na definição da forma da célula, dinâmica do citoesqueleto, viabilidade, fagocitose e sinal transdução vias4,8, 9,10,11. Quando empregado como um modelo ao lado o animal inteiro, linhas de células de Drosophila culturas oferecem um conjunto de abordagens muito complementares que acelerar a identificação de moléculas importantes para o desenvolvimento e fornecer um quadro em que a Determine suas funções mecanicista12. Aqui, descrevemos um ensaio baseados em células para estudar as vias de sinalização que provocam constrição apical através da gastrulação dobrado (Fog) via13,14. Este ensaio de contratilidade baseada em célula permite que os pesquisadores investigar os dois o nevoeiro sinalizando o caminho e os mecanismos moleculares que regulam a contratilidade II de miosina não muscular.

Gastrulação do embrião de Drosophila tem sido estudada por muitos anos como um modelo genético para a morfogênese epitelial e a transição celular de epiteliais para identidade de células mesenquimais. Um dos principais eventos da gastrulação é a morfogênese de um subconjunto de células epiteliais ao longo da linha mediana ventral embrionária desde colunar para piramidal em forma15,16,17,18. Esta forma simples célula alterar resultados na internalização das células mesodermal presuntivas e é impulsionado pelo motor atividade de miosina não muscular II comprimindo a actina rede16,19,20. Décadas de pesquisa genética identificou os componentes moleculares deste percurso e sequencialmente colocou-os na seguinte ordem: 1) nevoeiro é secretado do domínio apical das células epiteliais em relação à linha mediana ventral; 2) nevoeiro vincula os G-co receptores, neblina e nevoeiro e sinaliza através de uma via G-proteína complexo que contém a subunidade de12/13 Gα Concertina (Cta), que é acompanhada por Ric o GEF não-canônicos-8; 3) Cta ativa um fator de troca do nucleotídeo guanina, RhoGEF2, que por sua vez ativa o pequeno G-proteína Rho1; 4) Rho1 ativa a quinase Rho (Rok); 5) Rok ativa contratilidade de miosina não muscular II o domínio apical através da fosforilação da cadeia leve reguladora (RLC), assim produzindo constrição apical (Figura 1)15,21,22 ,23,24,25,26,,27,28,29. Mutações em vários desses componentes interferem com a normal gastrulação e outros movimentos morfogenéticas, incluindo a formação do disco asa e glândulas salivares, indicando que este caminho é usado em várias fases da drosófila embriogênese de31,30,32. O caminho de nevoeiro é um dos modelos mais bem estudados para moldar epiteliais e forneceu importantes insights sobre como nível de tecido morfogênese é regulada de transcrição do gene para movimentos de orientados para o citoesqueleto celular14,15 ,21.

Desenvolvemos um ensaio de contratilidade baseada em célula que recapitula a muitos a resposta celular a jusante de nevoeiro que têm sido observada no desenvolvimento de embriões voar17. Nós produzimos um S2 estável linha celular que expressa a névoa marcada no seu C-terminal com myc sob o controle de um promotor inducible metallothionine que pode ser colhido após a adição de sulfato de cobre (CuSO4) ao meio. Quando nevoeiro-condicionado mídia é aplicada ectopically para células S2 receptores + (S2R +), que são uma rubrica de células S2 distinguidos pela sua expressão diferencial de receptores como subunidades Frizzled e integrina, as pilhas se submetem a uma reorganização do citoesqueleto altamente reminiscente de constrição apical12,17,,27,33. Estas mudanças podem ser observadas por microscopia de contraste de fase, na qual nevoeiro tratamento leva ao aparecimento de fase-escuro babados indicativos de um aumento radial na contratilidade II de miosina não muscular, ou por microscopia de fluorescência onde o nevoeiro tratamento leva para o formação de anéis de miosina não muscular II em células expressando RLC EGFP-marcou34. Estes anéis contêm uma cadeia leve reguladora-miosina fosforilada (pRLC) visível através de imunocoloração23,34,35. Esta resposta induzida pelo nevoeiro obrigatório Cta, RhoGEF2, Rho e Rok; assim, usando recombinante nevoeiro-Myc e células S2R +, nós estabelecemos um meio para investigar a constrição induzida por névoa em um sistema de baseados em tecido-cultura24,25,34.

Protocol

1. manutenção de células de cultura de tecidos de Drosophila Manter S2R + S2R +: RLC-EGFP e S2:Fog-células Myc à temperatura ambiente, preferencialmente entre 20 ° C e 25 ° C, no escudo e cantou M3 inseto suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina, 100 µ g/mL Estreptomicina e 0,25 anfotericina B em um densidade não inferior a 5 x 105 células/mL.Nota: Baixa densidade celular leva à morte. Rapidamente descongelar frascos de crio-preservados de células e transferi-los para um frasco de cultura de tecidos. Comece com um frasco pequeno de cultura de tecidos (12,5 cm2 ou 25 cm2) em um volume de 4-5 mL de meio de cultura celular até que a cultura é estabelecida e sinais de morte celular devido a descongelar tenham desaparecido.Nota: Sinais de morte celular devido a descongelar incluem células não-aderentes que carecem de uma forma suave, arredondada e escuros pedacinhos de restos celulares em cultura de tecido médio indicativo das células necróticas. Lentamente aumenta o tamanho da cultura do tecido, permitindo que as células a crescer sem ser perturbado por vários dias (4-8 d) a confluência de 100%, onde não há pouco ou nenhum espaço entre as células e começam a amontoar-se uns com os outros. Transferi todas as células desta 100% confluentes menores 12,5 cm2 , ou o balão 25cm2 para um frasco de cultura de tecido maior (de 75 cm2) suplementado com 10 mL de meio de cultura celular.Nota: Manter as células em um frasco de 75 cm2 irá produzir células suficientes para a maioria dos experimentos. Passagem das células cada 3-4 d pipetando o meio de cultura celular e para baixo, usando-o para desalojar as células frouxamente aderidas a cultura do tecido plástico. Transferi este meio, agora contendo as células ressuspensa, aferido de fresco. Diluir 1:4 células com meio de cultura celular fresco com cada passagem e repita, conforme necessário. 2. RNAi tratamento de células de Drosophila S2R + Nota: Consulte Rogers e Rogers6 para obter instruções detalhadas sobre como produzir dsRNA apropriado para cultura de insetos. Transferi células S2R + para uma placa de cultura de tecido bem 6 ou 12-poços em uma densidade conducente para a viabilidade, não menor do que 5 x 105 células/mL, usando completo escudo e cantou M3 célula meios de cultura para tratamentos de RNAi. Trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, remova o meio de cultura celular velho delicadamente inclinando a placa de cultura de tecido bem 6 ou 12-poços e aspirando o meio de cultura celular com uma pipeta. Substitua rapidamente este meio de cultura celular velho com a 1 mL de meio de cultura celular fresco pipetando-lo em cada poço.Nota: Isto pode ser feito sem perda substancial após as células foram autorizadas a aderir livremente por 30-45 min antes de trocar o meio de cultura celular. Adicionar 10 µ g/mL de dsRNA que tem sido gerado seguindo o protocolo detalhado em Rogers e Rogers6 pipetando-lo diretamente no meio de cultura de tecido de cada poço de células por condição de RNAi. Repita este procedimento diariamente, substituindo o meio de cultura celular com 1 mL de meio fresco e 10 µ g/mL de dsRNA por condição de RNAi.Nota: Experimentos de RNAi normalmente são realizados para 7D; no entanto, o momento exato é dependente do volume de proteína e eficácia do dsRNA. Tratamentos de RNAi tão curtos quanto 3 d efetivamente empobrecem células de certas proteínas, enquanto outros alvos exigem mais tratamentos6. 3. produção e colheita de nevoeiro Intensificar o crescimento do S2:Fog-células Myc, permitindo que eles cresçam intacta para 4-8 d obter um quase 100% confluentes 75cm2 frasco de células em 10 mL de célula meio de cultura (ou, alternativamente, um balão de 150cm2 em 20 mL de meio de cultura celular) para maxi Mize produção de névoa. Adicione 50 µ l de 100mm CuSO4 (ou 100 µ l de CuSO4 100mm para um balão de 150cm2 ) no balão de quase 100% confluentes 75cm2 para a indução do promotor metallothionine. Incube durante 48 h à temperatura ambiente. O nevoeiro-Myc-contendo meio Retire o frasco de cultura de tecidos pipetando e transferir para um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL. Centrifugar a 2.500 x g a 4 ° C, durante 10-15 min limpar o meio de células e restos celulares. O meio de celular limpo de transferência para um novo tubo cónico e mantê-lo no gelo. Trabalhando em lotes, transfira 5 mL do meio de apuradas para 15 mL de 3.000 concentradores de MW com membranas de celulose regenerada e centrifugar a 2.500 x g a 4 ° C por 30 min em um momento, para concentrar-se o meio.Nota: Como alternativa, um concentrador com uma maior capacidade de volume pode ser usado (50 mL). Durante a concentração, um meio colorido mais escuro, que é enriquecido com nevoeiro, começará a acumular na parte inferior do filtro em forma de V. Inserir a ponta da pipeta no fundo do “V” do concentrador e remova a mídia colorida mais escura entre cada rodada de centrifugação e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL fresco. Manter os meios de comunicação no gelo. Usando o mesmo concentrador, repita etapas 3.4 e 3.5, removendo a cor mais escura concentraram mídia nevoeiro-Myc e substituí-lo com mais lisado médio, até que a mídia tem sido concentrada para 1/10 do seu volume original (ou seja, 1 mL de 10 mL de matérias-primas). Armazenar o nevoeiro-Myc concentrada em 4 ° C.Nota: Após o armazenamento, certifique-se monitorar a contaminação bacteriana, que pode ser resultado de longos períodos de armazenamento. Execute SDS-PAGE, misturando-se 10 µ l de meio de nevoeiro-Myc concentrado com 10 µ l de um buffer contendo SDS desnaturação para formar um lisado. Executar o gel de SDS-PAGE 35 mA para aproximadamente 1 h. transferir o gel para uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, uma membrana PVDF) por 1h em 120 mA. Realize um western blot utilizando qualquer anticorpo Myc comercialmente disponível para detectar uma faixa de 150-kDa.Nota: A concentração de nevoeiro-Myc no meio condicionado pode variar por lote. Não é necessário determinar a concentração exacta de nevoeiro-Myc para realizar o ensaio, mas a eficácia de cada lote deve ser testada antes de realizar um experimento. Seguintes passos 3.1-3.2, preparam o controle de mídia S2-condicionado pela coleta de 10 mL de meio de cultura celular de quase 100% confluentes 75cm2 balão de células S2 (ou, alternativamente, 20 mL de um frasco de 150 cm2 ) pipetando. Transferi o controle do meio de cultura celular S2 para um novo tubo cônico de 15 mL ou 50 mL. Passos a seguir 3.4-3.7, limpar o lisado de células e restos celulares por centrifugação (a 2.500 x g a 4 ° C por 30 min de cada vez) e então transfira o lisado celular total apurado para concentradores e centrifugar para concentrar-se o meio de controle em lotes para 1/10 do volume original.Nota: Aplicação dos meios de comunicação S2-condicionado não conduzir a contratilidade celular substancial no ensaio. Armazene a mídia concentrada de controle de S2 a 4 ° C por vários meses.Nota: Após o armazenamento, certifique-se monitorizar a contaminação. 4. preparação de pratos de vidro de fundo Concanavalina-A-revestido e o chapeamento de células S2R + Fazer 10 mL da Concanavalina uma solução (con A) dissolvendo-se 5 mg de con A 10 mL de água para uma concentração final de 0,5 mg/mL. Alíquota desta solução em volumes mais convenientes (500 µ l a 1 mL) e armazená-lo a-20 ° C. Preparar pratos de 35mm com fundo de vidro revestindo a parte de vidro de cada prato com 200 µ l da solução de con A e incubar os pratos por aproximadamente 2 min à temperatura ambiente em um capuz de cultura de tecidos. Em seguida, remover todas a con uma solução (que pode ser mantida e reutilizada para experiências futuras) e permitir que os pratos secar completamente.Notas: Pratos podem ser preparados em grandes lotes e podem ser armazenados por até 6 meses em lugar seco, como uma gaveta de bancada de laboratório. Adicione aproximadamente 2 mL de meios de cultura de células frescas para cada prato com fundo de vidro. Ressuspender as células S2R + a ser testado pelo ensaio pipetando o meio de cultura celular acima e para baixo, usando-o para desanexar quaisquer células frouxamente aderidas. Transferi as ressuspensão S2R + células para os pratos com fundo de vidro-35mm, contendo meio de cultura de células frescas estão entre 50% – 70% de Confluencia. Verificar a densidade de células sob o microscópio de cultura de tecidos, centrando-se acima e para baixo através de várias planícies das células suspendidas no meio para obter uma estimativa do número de células.Nota: Através de tentativa e erro, a densidade adequada de células necessárias para alcançar a confluência de 50% – 70% pode ser alcançada. Permitir que as células anexar para os con-A-revestido com fundo de vidro pratos por 45-60 min.Nota: Células S2R + totalmente anexadas aparecem ‘frito-ovo-como,’ achatada e fase escura. 5. teste eficácia do meio de nevoeiro-condicionado e o ensaio da contratilidade celular Se desejado, confirmar o rendimento do nevoeiro-Myc produzido e concentrada de S2:Fog a-stable Myc células linhas por SDS-PAGE e mancha ocidental. Adicione 10 µ l de tampão de amostra SDS-contendo a 10 µ l de concentrado nevoeiro-Myc e ferver por 5 min. Siga o padrão de SDS-PAGE e protocolos mancha ocidentais e borre para anti-Myc confirmar a produção de névoa-Myc. Remover todo o escudo e cantou M3 médio de anexado S2R + células da etapa 4.3 pipetando suavemente e cuidadosamente adicione volta 75 µ l de meio escudo e Sang fresco para limitar a quantidade de névoa-condicionado meio utilizado. Adicione 75 µ l de mídia nevoeiro-condicionado à parte de vidro do prato com fundo de vidro da etapa 5.2 para trazer o volume total de 150 µ l, na proporção de 1:1 da mídia nevoeiro-condicionado ao escudo e cantou M3 mídia.Nota: Um volume total de 150-200 µ l é necessário para cobrir totalmente a parte de vidro do prato típico com fundo de vidro; no entanto, isso vai depender das dimensões do prato com fundo de vidro usado. Monitore a contratilidade das células por microscopia de contraste de fase usando 20 X ou 40 X de ampliação para observar um campo inteiro de células. Controlar a morfologia das células e olhar para o padrão alternado de fase escura e a luz de fase ruffling indicativo da mudança de forma.Nota: A aplicação do nevoeiro conduz normalmente a 30% – 50% das células S2R + passando por constrição celular, e depois de 10 min, as células começam a relaxar, retornando a sua morfologia com arestas suaves, frito-ovo-like. Monitore a robustez da contratilidade celular. Se a resposta das células é muito forte, usando uma proporção de 1:1 da névoa-condicionado médio e meio fresco, escudo e Sang, reduza a quantidade de névoa-condicionado médio para conservar o meio de nevoeiro-Myc concentrado para experiências futuras. Uso não diluído nevoeiro-condicionado médio se uma proporção de 1:1 não leva à constrição celular robusta; Geralmente, um rácio de 1:3 produz suficiente resposta com sucesso realizar o experimento.Nota: Uma vez que a relação apropriada de nevoeiro-condicionado médio e meio fresco, escudo e Sang é estabelecida por dado lote de meio de nevoeiro-condicionado, use esta relação para todas as outras experiências. Monitorar a dinâmica de miosina não muscular II durante o ensaio de contratilidade celular usando a estável S2R + linha celular que expressa a cadeia leve reguladora GFP-etiquetado (S2R +: Sqh-EGFP). Usando a relação estabelecida do nevoeiro-condicionado meio meio escudo e cantou M3 fresco do passos 5.2-5.5, remover o meio celular-cultivadas com uma pipeta e adicionar meio escudo e Sang volta fresco na porção do prato de vidro com fundo de vidro. Perfundir nevoeiro-condicionado médio na proporção predeterminada durante a aquisição de uma sequência de imagens de células vivas; Cuide para não mover o prato com fundo de vidro durante a perfusão. 6. fixação e coloração de células constringido S2R + Corrigi S2R + células usando uma solução de paraformaldeído 10% em tampão PEM (tubos de 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).Nota: PEM buffer é normalmente feita em 2 x solução estoque e pode ser armazenada por meses a 4 ° C. Remover o meio de cultura celular de células tratada com nevoeiro S2R + pipetando e substituí-lo imediatamente com 1,5-2,0 mL de solução 10% paraformaldeído. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente.Nota: Células fixas podem ser armazenadas em solução de fixação a 4 ° C por vários dias; no entanto, é importante que a fixação de 15min inicial é feita à temperatura ambiente antes de transferir as células para 4 ° C. Remova a solução 10% paraformaldeído pipetando e descarte deste produto de resíduos orgânicos corretamente. Enxague as células pipetando suavemente 1,5-2,0 mL de tampão fosfato salino (PBS) para o prato de 35mm com fundo de vidro. Remover a velha PBS pipetando e substituí-lo com 1,5-2,0 mL de PBS fresco 2 x mais para remover a solução residual de fixação.Nota: É importante que as células não secar a partir deste ponto no protocolo. Bloquear as células com aproximadamente 200 µ l de soro de cabra normal 5% diluído em PBS que foi complementado com detergente não-iônico 0,1% (PBST) por 20 min em temperatura ambiente.Nota: Normalmente, bloqueio soluções contêm soro que coincide com os anticorpos secundários são produzidos no organismo. Prepare a solução de anticorpo primário por diluir em PBST. Use um volume de aproximadamente 200 µ l para cobrir completamente a parte de vidro do prato com fundo de vidro. Remover a solução bloqueio pipetando e adicionar a solução de anticorpo primário diretamente para a parte de vidro do prato. Incubar durante 1 h em temperatura ambiente ou, alternativamente, incubar durante a noite a 4 ° C. Quando incubando durante a noite a 4 ° C, embrulhe o prato com fundo de vidro de 35 mm com parafilm para evitar a evaporação. Remover a solução de anticorpo primário por pipetagem e enxágue as células por pipetagem 1,5-2,0 mL de PBS fresco ao prato 35mm com fundo de vidro. Remover o PBS pipetando e substituí-lo com 1,5-2,0 mL de PBS fresco 2 x mais. Prepare uma solução de anticorpo secundário por diluir em PBST. Um volume de 200 µ l é suficiente para cobrir apenas parte do prato de vidro. Adicione a solução de anticorpo secundário diretamente para a parte de vidro do prato. Incube as celulas com solução de anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Embrulhe o prato 35mm com parafilm se incubando durante a noite, para evitar a evaporação. Remova a solução de anticorpo secundário pipetando e enxágue as células com PBS por pipetagem 1,5-2,0 mL de PBS fresco ao prato. Remover a PBS velha e substituí-lo 2x mais, seguindo o mesmo procedimento. Preserve as células fixas e manchas, adicionando o suficiente de um meio de montagem fluorescente antidesvanece-se para cobrir a parte de vidro do prato 35mm com fundo de vidro. Armazene as amostras em 4 ° C e longe da luz.Nota: O sinal fluorescente deteriorará lentamente durante meses mesmo se armazenado corretamente. Para melhores resultados, imagem dentro de uma semana. 7. imagens e quantificação do ensaio contratilidade celular Imagem fixada S2R + células usando um padrão invertido microscópio com contraste de fase, DIC ou fluorescência recursos de imagem. Usando o X de 20 ou 40 X de ampliação, capture 10-30 campos de imagem que não se sobrepõem de células dependendo da densidade da célula, com o objetivo de adquirir as imagens de 200 ou mais células por condição. Usando um contador de célula padrão, contar e registrar o número de contratados (fase escura, bicudas células) e células noncontracted por cada campo capturado.Nota: É melhor ter dois pesquisadores tomar independentes contagens de células noncontracted e contratadas por campo, ou alternativamente, o mesmo pesquisador pode contar o mesmo campo de imagem de células três vezes, permitindo um número médio de contratados e noncontracted células por campo deve ser calculado. Prepare vários con-A-revestido com fundo de vidro pratos por condição experimental conforme descrito na etapa 4.2. Pipetar e descer o meio de cultura celular para desalojar qualquer células S2R +: Sqh-EGFP frouxamente aderentes e placa-los para que sejam 50% – 70% confluente nos pratos 35mm com fundo de vidro. Permitir que as células anexar por 30-45 minutos. Imagem da S2R +: Sqh-EGFP células ao vivo usando um microscópio confocal-disco giratório, varreu-campo ou pela microscopia de luz-folha 60 X – ampliação de 100 X. Remova todo o escudo e cantou M3 médio do prato com fundo de vidro que contém células de S2R +: Sqh-EGFP anexadas. Perfundir a proporção predeterminada de nevoeiro-Myc meio condicionado de meio fresco, escudo e cantou M3 de passos 5.2-5.5 diretamente sobre a parte de vidro do prato com fundo de vidro com uma pipeta, cuidadosa como para não incomodar a posição do prato no objectivo. Adquira imagens para 12-15 min a fim de capturar a iniciação e a completa contração das células S2R +: Sqh-EGFP.Nota: Se a mancha para miosina não muscular ou miosina-pRLC, a formação de um anel de miosina apertado na superfície das células também é indicativa de contratilidade. Se células S2R +: Sqh-EGFP ao vivo, o RLC com tag EGFP formarão semelhante apertado de imagem anéis da contratilidade, do modo indicativo (ver Figura 3). A mudança de forma que ocorre fará com que as células para “boné”, ocupando a forma 3D; o plano de foco do microscópio pode precisar de ser ajustados para rastrear essa alteração de forma de célula. Sob controle condições de RNAi, normalmente, 30% – 50% das células sofrem constrição sobre a adição de nevoeiro. Esteja ciente de que algumas condições de RNAi podem levar à constrição na ausência de nevoeiro.

Representative Results

S2 e S2:Fog-Myc células foram crescidas para perto condições confluentes num frasco de cultura de tecidos de 150cm2 e foram tratadas com 25-75 µM CuSO4 durante um período de 24-48 horas para induzir a expressão de nevoeiro-Myc (Figura 2). Amostras de células S2(Figura 2)e S2:Fog-células Myc (Figura 2B) foram removidas e produção de névoa-Myc foi monitorizada pelo borrão ocidental. Como esperado, não conseguimos detectar o nevoeiro-Myc em mídia colhidas das células S2 sob quaisquer condições. No entanto, nós detectar nevoeiro na mídia colhidas a partir do S2:Fog-linha de célula estável Myc logo em 24 horas após a indução com 75 µM CuSO4. S2R + células anexadas aos pratos com fundo de vidro revestido con-A expressando uma EGFP-tag regulamentar cadeia leve (GFP-RLC) de não-músculo miosina II (Figs. 3A e 3B). Imagem latente da viver-pilha foi realizada em um microscópio invertido equipado com 100 X / 1.4 NA lente objetiva durante a perfusão de nevoeiro-condicionado mídia. Aproximadamente 5 minutos pós-tratamento com nevoeiro-Myc, o RLC formados anéis indicativos de constrição de não-músculo miosina II. Estes anéis podem ser observados através de imunocoloração S2R + células com um anticorpo contra uma Fosfopeptida sintética, correspondente a resíduos em torno de Ser19 de miosina humana RLC (figuras 4A e 4B). Este anticorpo cross-reacts com Drosophila RLC. Aqui temos um exemplo representativo do ensaio contratilidade celular após um tratamento de 7 dias de células com controle RNAi e dsRNA contra Rho1 (figuras 5A – 5E). S2R + células foram banhadas em pratos de vidro de fundo A con-revestido e tratados com nevoeiro-condicionado (+ Fog) mídia ou mídia de controle (-nevoeiro). O número de células contratadas foram quantificado em seguida após a fixação. O indicativo de fase densa babados de constrição foi proeminente nas células de controle empobrecido tratadas com nevoeiro-condicionado mídia (Figura 5B). Na Figura 5C, Rho empobrecido células tratadas com S2-condicionado médio são um exemplo típico da morfologia com arestas suaves, frito-ovo-like. Observe que o Rho desempenha um papel na via de sinalização de neblina, bem como na citocinese; assim, células de Rho-esgotada muitas vezes não conseguem dividir corretamente, levando a um aumento no tamanho da célula e ploidia. Tratamento de controle de células empobrecidas com mídia de nevoeiro-condicionado típica leva a 30% – 50% de células em fase de constrição, Considerando que nós não respeitou a constrição substancial nas células Rho-esgotada. Figura 1:a névoa putativa sinalização via. Na ausência de névoa, a subunidade Gα de12/13 , Concertina (Cta), juntamente com seus parceiros de ligação Gϒ e Gβ, são inativos e associados com os receptores co névoa e poluição atmosférica. Ric-8 controla a Cta e regula sua localização subcellular. Após nevoeiro vinculativas, Cta desassocia a partir Gϒ e Gβ RhoGEF2 de recrutas para a membrana da célula onde ele catalisa a troca de GDP por GTP na pequena GTPase Rho1. Rho1 GTP-limite, agora ativo, ativa a quinase de Rho (Rok), que fosforila o CTR de miosina não muscular, levando a sua ativação e subsequente contratilidade celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Tempo-curso de produção de névoa-Myc. Estes painéis mostram colhido num balão confluente perto de 100% de células de controle S2 (A) ou (B) S2:Fog de meio de cultura celular-células estáveis Myc. As células foram tratadas com 25-75 µM CuSO4 durante um período de 24-48 horas. O meio de cultura celular foi coletado e preparado para SDS-PAGE e mancha ocidental. Nevoeiro-Myc foi detectado por um anticorpo anti-Myc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Imagem latente da viver-pilha de constrição induzida pelo nevoeiro. Estável S2R + linhagens celulares expressando RLC com tag EGFP de miosina não muscular II foram fotografada pela microscopia confocal varreu-campo durante a perfusão de nevoeiro-condicionado mídia. Tempo é mostrado em minutos e segundos. (A), este painel mostra uma imagem de um plano focal perto da interface celular-lamela no tempo 0:00 antes da perfusão de nevoeiro-Myc. (B), este painel mostra uma série de tempo (0:30-10:00) de imagens tiradas em um plano focal perto do topo da célula. As setas brancas indicam a reorganização da miosina não muscular II conforme indicado pelo EGFP-RLC em anéis contrátil durante a constrição. Barra de escala é 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Phosphorylated-RLC localiza aos anéis contrátil após indução de constrição pela névoa-Myc. S2R + células eram fixas e manchadas para actina usando faloidina (vermelha), fosforilada RLC usando um anticorpo phosphoserine-19 (verde) e DAPI (DNA, azul), após o tratamento com controle de (A) ou (B) mídia de nevoeiro-Myc-condicionado. Observe a reorganização do RLC fosforilada em rodelas sobre a adição de nevoeiro-Myc. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Representante quantificação do ensaio contratilidade celular induzida por nevoeiro. S2R + células foram tratadas com controle (A e B) RNAi ou dsRNA (C e D) contra a pequena GTPase Rho1 durante 7 dias. Após este tempo, as células foram banhadas em con-A-revestido com fundo de vidro pratos e foram tratadas com mídia de controle (A e C) ou mídia de nevoeiro-Myc-condicionado (B e D). A escala da barra representa 10 µm. (E) A dispersão indica os intervalos de confiança média e 95% da fração de células contratadas por condição. Pontos individuais representam a fração de células contratadas por campo de visão ampliação de 40 X (10-120 células por campo) e os números entre parênteses indicam que o número total de células contadas por células contratadas e não contratados separado ao longo de três Experimentos de RNAi. Asteriscos denotam uma diferença estatisticamente significativa entre as condições de RNAi e névoa-tratada conforme determinado pela ANOVA One-Way (p < 0,0001) com análise de post hoc de comparação múltipla de Tukey. Observe que não houve diferença estatisticamente significativa (n.s.) entre as amostras tratadas Rho1 RNAi tratadas com controle ou com nevoeiro-Myc-condicionado mídia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para um ensaio de contratilidade baseada em célula usando uma linhagem de células de cultura de tecido do Drosophila (células S2R +), que sofre a constrição de miosina não muscular II como uma resposta a névoa de sinalização. Este ensaio é útil para investigar o caminho de nevoeiro, bem como os mecanismos que regulam a contratilidade II de miosina não muscular.

Cultivo celular considerações:
As condições sob as quais S2R + células são mantidas é fundamental para obter dados fiáveis deste ensaio. Durante o planejamento para realizar o ensaio de contratilidade, é melhor manter células S2R + escudo e cantou M3 médio de insetos. Enquanto células S2R + podem prosperar em outros meios de cultura de células de inseto (por exemplo, SF900 ou do Schneider inseto médio), muitas vezes perdem sua capacidade de resposta a neblina. S2R + células que possuem um número de passagem alta, geralmente mais de 20-25 passagens, começam a perder a sensibilidade de RNAi. É melhor usar células de início-passagem para todos os experimentos. Outro aspecto importante para experimentos de depleção de RNAi é escolher controlos adequados. Controles negativos comuns incluem dsRNA visando EGFP ou pBlueScript, nem de que ter homologia para o genoma da mosca. Direcionamento de proteínas na via da névoa (Rho, Rok, etc.), que, quando esgotadas, impedem a ativação da contratilidade de miosina não muscular, também são controles úteis. S2:Fog-células Myc podem ser mantidas em meio de cultura celular alternativo como SF900 suplementado com 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, e 0,25 anfotericina B. Note que FBS é não necessária ao cultivo de células em SF900. Densidade celular também é um componente crítico para todos os aspectos da drosófila células de cultura de tecidos. Ao contrário de células de cultura de tecidos de mamíferos, Drosophila-células de cultura de tecidos derivada prosperam melhor sob maiores densidades de célula (densidades não inferior a 5 x 105 células/mL). No entanto, ao realizar este ensaio, é fundamental que as células não são banhadas em con-A-revestido com fundo de vidro pratos acima da confluência de 80%, como a quantificação de células contratadas versus não-contratados se tornará extremamente entediante.

Aspectos críticos e abordagens alternativas do ensaio contratilidade celular:
A produção de névoa, o ligante que desencadeia a contratilidade II de miosina não muscular, é um componente chave deste teste. O nevoeiro gene codifica uma proteína de 730 aminoácidos com peso molecular previsto de ~ 78 kDa26. Análise de hidropatia revelou um trecho de 12 resíduos hidrofóbicos no amino-terminal do nevoeiro que poderia funcionar como uma sequência de sinal de secreção. Além disso, a sequência de código também contém vários locais para potenciais glycosylation N – e O-ligados, ainda mais, sugerindo que o nevoeiro é uma proteína secretada26. Para apoiar isso, nevoeiro era localizado, vesículas secretórias nas células epidérmicas presuntivas, submetidos a constrição apical16. Expressão de nevoeiro-Myc foi induzido mediante adição de sulfato de cobre para o meio, e anticorpos contra névoa ou Myc reconheceram uma proteína 150-kD do meio de cultura colhidas das culturas induzidas, mas não de induzida por meios de células S2 falta construção de nevoeiro-Myc. Este peso molecular foi maior do que o peso molecular 80-kD previsto de nevoeiro e sugere que o mecanismo secretor de células S2 pode glycosylate a proteína antes da exocitose. Devido à variabilidade potencial na purificação do nevoeiro, é aconselhável usar o mesmo lote de nevoeiro-condicionado mídia para todos os experimentos. Compõem grandes lotes de mídia concentrada de nevoeiro-Myc ajudará em manter a coerência ao longo de rodadas de experimentos.

O sucesso deste teste depende, também, com confiança, identificar as células que foram submetidos a constrição. Enquanto constringidas células podem ser observadas por microscopia de fluorescência, manchando para actina ou miosina não muscular II, a maneira mais confiável para identificar e quantificar células constringidas é através de contraste de fase ou microscopia DIC. Conta exata pode ser conseguida usando 20 X – ampliação de X 40 em microscópios de luz mais padrão. Embora o protocolo escrito aqui usa pratos com fundo de vidro, o ensaio também pode ser realizado usando padrão 1.5 as lamelas de vidro revestidas con a. A adição de neblina pode ser feita em 35 milímetros de cultura de tecido em uma lamela colocada no parafilm, a fim de limitar a quantidade de névoa utilizada para cada ensaio. A qualidade da fixação é um componente crítico do ensaio, como células mal fixas podem levar a falsos positivos. Usando a solução de fixação fresco e certificando-se de… as células nunca seque uma vez fixadas levará a resultados mais confiáveis. Finalmente, é importante contar com um grande número de células. Normalmente, não tratada apenas 30% – 50% de ou células de RNAi-Tratado de controle se contraem após a perfusão de nevoeiro. No entanto, há um nível basal de constrição que ocorre em células S2R +, portanto, um grande número de células é necessária para garantir que qualquer alteração na fração de células constringidas é devido a tratamentos. Além disso, o esgotamento de algumas proteínas envolvidas na regulação da contratilidade II de miosina não muscular pode levar a hipercontratilidade, mesmo na ausência de nevoeiro. Os dados aqui apresentados são de mais de 3.600 células que foram contadas em três tratamentos de RNAi sucessivos, usando o mesmo lote de nevoeiro-condicionado mídia.

Aplicações do ensaio contratilidade celular:
Este ensaio de contratilidade, quando acoplado com RNAi triagem métodos, oferece um poderoso sistema para estudar a sinalização celular, morfogênese e contratilidade celular. Anteriormente, ela tem sido usada para identificar um dos dois receptores co de nevoeiro21. Uma tela específica de 138 G-receptores (GPCRs) está esgotada por RNAi em células S2R +, e sua capacidade de responder a neblina foi analisada conforme descrito no protocolo aqui apresentado. Das 138 GPCRs, um único gene anteriormente descaracterizada, agora conhecido como névoa, foi descoberto. Outras investigações em função da neblina demonstraram que não só era necessitava para contratilidade celular induzida por nevoeiro na S2R + células, mas também era essencial para gastrulação no desenvolvimento de Drosophila21. Além disso, este ensaio foi usado para demonstrar que Ric-8, um não-canônicos GEF, é também um componente no nevoeiro caminho27de sinalização. Uma série de experimentos de RNAi epistasia juntamente com o ensaio de contratilidade demonstrou que Ric-8 interage com a subunidade de12/13 Gα Cta e funções para localizá-lo dentro da célula, que é crítica para contratilidade celular induzida por nevoeiro31 .

Cultura de tecidos de Drosophila é adequada para iniciantes, como as células são facilmente mantidas em temperatura ambiente, não necessitam de CO2 ou em buffer de meio de cultura celular e são robustas, enquanto densidades de cultura celular adequada são mantidas. O ensaio da contratilidade celular foi realizado com êxito pela seção de laboratório de um curso de biologia celular de graduação, onde os alunos não tinham pouca ou nenhuma experiência com o cultivo de células ou microscopia. O ensaio de contratilidade celular aqui apresentado representa uma ferramenta poderosa, baseada em células que pode ser empregada na descoberta do gene, ou para interrogar o nevoeiro via de sinalização, ajudando-na melhor compreender os processos do desenvolvimento, tais como a constrição apical e contratilidade do II de miosina não muscular, em geral.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer os membros do laboratório de Rogers e o laboratório de Applewhite, Greta Glover e os alunos no curso de biologia celular da faculdade Reed Primavera 2018, que contribuíram para o desenvolvimento do presente protocolo. Além disso, os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório Ritz para ler cuidadosamente e edição deste manuscrito. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pela Fundação Nacional de ciência sob número prêmio 716964 D.A.A. e A.R. e departamento de biologia da faculdade de Reed.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
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References

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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
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