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Developmental Biology

Un'analisi Cell-based per indagare Non muscolo-miosina II contrattilità tramite la gastrulazione piegato la via di segnalazione in cellule di Drosophila S2R +

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Qui descriviamo un’analisi di contrattilità usando cellule di Drosophila S2R +. L’applicazione di un ligando esogeno, piegato gastrulazione (nebbia), conduce all’attivazione della nebbia del signaling pathway e cellular contrattilità. Questa analisi può essere usata per studiare la regolazione delle proteine cellulari contrattilità nella nebbia via di segnalazione.

Abstract

Abbiamo sviluppato un test basati su cellule usando le cellule della drosofila che ricapitola la costrizione apicale iniziata da piegato gastrulazione (nebbia), secreta morfogeno epiteliale. In questa analisi, la nebbia è utilizzato come un agonista per attivare Rho attraverso una cascata di segnali che include un ricevitore G-proteina-accoppiati (nebbia), una proteina di12/13 di Gα (Concertina/Cta) e un fattore di guanina nucleotide PDZ-dominio-contenente exchange (RhoGEF2). Segnalazione risultati nella riorganizzazione del citoscheletro per formare una stringa di borsa contrattile rapida e drammatica della nebbia. Nebbia solubile è raccolto da una linea cellulare stabile e applicato ectopically S2R + cellule, portando a cambiamenti morfologici come costrizione apicale, un processo osservato durante processi di sviluppo come la gastrulazione. Questo test è suscettibile di screening ad alta resa e, mediante RNAi, può facilitare l’identificazione di ulteriori geni coinvolti in questa via.

Introduction

Gli studi dell’embriogenesi condotte con organismi modello genetico hanno dimostrato inestimabili per la nostra comprensione di come le cellule sono assemblate nei tessuti. Studi di Drosophila melanogaster, in particolare, hanno portato alla identificazione di geni chiave e principi biologici che dirigono la morfogenesi e lo sviluppo di organismi dalla fecondazione alla età adulta1,2 , 3. in parallelo alla ricerca genetica condotta con Drosophila, linee cellulari coltivate derivate da tessuti di Mosca della frutta sono emerse anche come un potente sistema per affrontare una vasta gamma di molecolare e biologica delle cellule domande4, 5 , 6. cellule di coltura del tessuto della drosofila hanno requisiti minimi per la manutenzione, in quanto sono coltivate a temperatura ambiente e senza CO2. Come tali, essi sono suscettibili di imaging ad alta risoluzione, e hanno un alto grado di suscettibilità all’inibizione del gene di RNAi6,7. Molti gruppi hanno utilizzato cellule di coltura del tessuto della drosofila come uno strumento per scoprire geni coinvolti nella definizione di forma delle cellule, dinamiche del citoscheletro, vitalità, fagocitosi e signal transduction pathways4,8, 9,10,11. Quando impiegato come un modello a fianco l’animale intero, linee di cellule coltivate Drosophila offrono una serie di approcci molto complementari che accelerare l’identificazione di molecole importanti per lo sviluppo e fornire un quadro in cui determinare i loro ruoli meccanicistico12. Qui, descriviamo un saggio basato su cellule per studiare le vie di segnalazione che attivano la costrizione apicale tramite la gastrulazione piegato (nebbia) via13,14. Questo test di contrattilità basati su cellule permette ai ricercatori di studiare sia la nebbia signaling pathway e i meccanismi molecolari che regolano la contrattilità II della miosina non-muscolare.

Gastrulazione dell’embrione della drosofila precoce è stato studiato per molti anni come modello genetico per la morfogenesi epiteliale e la transizione cellulare da epiteliale all’identità delle cellule mesenchimali. Uno degli eventi chiavi della gastrulazione è la morfogenesi di un sottoinsieme delle cellule epiteliali lungo il midline ventrale embrionale da colonnare a piramidale in forma15,16,17,18. Questa forma di cellulare semplice modifica genererà l’interiorizzazione delle cellule mesodermal presuntiva ed è guidato dall’attività motoria non muscolo-miosina II restringendo l’actina rete16,19,20. Decenni di ricerca genetica ha identificato le componenti molecolari di questa via e li ha posti in sequenza nell’ordine seguente: 1) nebbia è secernuto dal dominio apicale delle cellule epiteliali al midline ventrale; 2) nebbia si lega ai G-proteina-accoppiato Co-recettori, nebbia e Smog e segnali attraverso un eterotrimerica G-proteina complessa contenente la subunità di12/13 di Gα Concertina (Cta), che è fatto da accompagnatore di Ric non canonico di GEF-8; 3) Cta attiva un fattore di scambio di nucleotide della guanina, RhoGEF2, che a sua volta attiva la piccola Rho1 G-proteina; 4) Rho1 attiva la chinasi Rho (Rok); 5) Rok attiva contrattilità II della miosina non-muscolare a livello apicale di dominio attraverso la fosforilazione della catena leggera normativa (RLC), producendo così la costrizione apicale (Figura 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutazioni in diversi di questi componenti interferiscono con la gastrulazione normale e altri movimenti morfogenetici, compresa la formazione del disco di ala e ghiandole salivari, che indica che questo percorso viene utilizzato in diverse fasi della drosofila l’embriogenesi30,31,32. Il pathway di nebbia è uno dei modelli meglio studiati per modellare epiteliale e ha fornito importanti intuizioni come livello di tessuto morfogenesi è regolata dalla trascrizione genica a cella citoscheletro-driven movimenti14,15 ,21.

Abbiamo sviluppato un saggio di contrattilità basati su cellule che ricapitola molte delle risposte cellulari a valle della nebbia che sono state osservate nello sviluppo di embrioni fly17. Abbiamo progettato un S2 stabile linea cellulare che esprime nebbia etichetta al suo C-terminale con myc sotto il controllo di un promotore inducibile metallothionine che può essere raccolto al momento dell’aggiunta di solfato di rame (CuSO4) al mezzo. Quando nebbia-condizionato media viene applicato ectopically a cellule recettori S2 + (S2R +), che sono un subline delle cellule S2 distinto dalla loro espressione differenziale dei recettori come subunità Frizzled e integrina, le cellule subiscono una riorganizzazione della citoscheletro è altamente ricordano di costrizione apicale12,17,27,33. Questi cambiamenti possono essere osservati da microscopia di contrasto di fase in cui nebbia trattamento porta alla comparsa di fase-scuro ruffles indicativo di un aumento di radiale nella contrattilità II della miosina non muscolare, o mediante microscopia a fluorescenza dove nebbia trattamento porta alla Formazione di anelli di miosina non muscolo-II in cellule che esprimono EGFP-etichetta RLC34. Questi anelli contengono una catena leggera della miosina fosforilata normativo (pRLC) visibile tramite immunostaining23,34,35. Questa risposta indotta da nebbia necessaria Cta, RhoGEF2, Rho e Rok; così, utilizzando ricombinante nebbia-Myc e cellule S2R +, abbiamo stabilito un mezzo per indagare riduzione indotta da nebbia in un sistema basato su tessuto-colture24,25,34.

Protocol

1. mantenimento delle cellule di coltura del tessuto della drosofila Mantenere S2R +, S2R +: RLC-EGFP e S2:Fog-cellule Myc a temperatura ambiente, preferibilmente tra 20 ° C e 25 ° C, Mezzo insetto scudo e cantato M3 completati con 10% siero bovino fetale, 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 0,25 amfotericina B a un densità non inferiore a 5 x 105 cellule/mL.Nota: La bassa densità delle cellule portare alla morte. Scongelare i flaconcini di crioconservazione delle cellule e trasferirli in un matraccio di cultura del tessuto rapidamente. Iniziare con una boccetta di piccola coltura tissutale (12,5 cm2 o 25 cm2) in un volume di 4-5 mL di terreno di coltura cellulare fino a quando la cultura è stabilita e segni di morte delle cellule dovuto lo scongelamento si sono calmati.Nota: Segni di morte delle cellule a causa di scioglimento sono cellule non aderenti che non dispongono di una forma liscia, arrotondata e scuri piccoli frammenti di detriti cellulari dell’indicativo medio di coltura del tessuto delle cellule necrotiche. Lentamente di scalare la dimensione della cultura del tessuto consentendo alle cellule di crescere indisturbati per diversi giorni (4-8 d) al 100% confluency, dove non c’è poco o nessun spazio tra le celle e cominciano ad accumularsi uno su altro. Trasferire tutte le celle da questo 100% confluenti più piccolo 12,5 cm2 o pallone da 25 cm2 in un più grande pallone di coltura del tessuto (di 75 cm2) completato con 10 mL di terreno di coltura cellulare.Nota: Mantenere le cellule in una boccetta di 75 cm2 produrrà abbastanza cellule per la maggior parte degli esperimenti. Passaggio delle cellule ogni 3-4 d pipettando su e giù il mezzo di coltura cellulare, usando per rimuovere qualsiasi vagamente aderito cellule dalla coltura del tessuto plastica. Trasferire questo mezzo, che ora contiene cellule del sedimento, in un matraccio da fresco. Diluire le cellule 1:4 con terreno di coltura di cellule fresche con ogni passaggio e ripetere se necessario. 2. trattamento RNAi della drosofila S2R + cellule Nota: Fare riferimento a Rogers e Rogers6 per istruzioni dettagliate su come produrre dsRNA adatta per la coltura dell’insetto. Trasferimento S2R + cellule ad una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti o 12-pozzetti ad una densità favorevole per la redditività, non inferiore a 5 x 105 cellule/mL, utilizzando completo scudo e cantato M3 delle cellule di coltura per i trattamenti di RNAi. Lavorando in una cappa di coltura del tessuto, rimuovere il vecchio mezzo di coltura cellulare delicatamente inclinando la piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti o 12-pozzetti e aspirando il mezzo di coltura cellulare con una pipetta. Sostituire rapidamente questo vecchio terreno di coltura cellulare con 1 mL di terreno di coltura di cellule fresche pipettando in ciascun pozzetto.Nota: Questo può essere fatto senza perdita sostanziale dopo che le cellule hanno potute aderire liberamente per 30-45 min prima lo scambio di medium della coltura cellulare. Aggiungere 10 µ g/mL di dsRNA che è stato generato seguendo il protocollo dettagliato in Rogers e Rogers6 pipettando esso direttamente nel terreno di coltura del tessuto di ciascun pozzetto di cellule per condizione di RNAi. Ripetere questa procedura ogni giorno, sostituendo il terreno di coltura cellulare con 1 mL di terreno nuovo e 10 µ g/mL di dsRNA a condizione di RNAi.Nota: Esperimenti di RNAi sono in genere effettuati per 7 d; Tuttavia, l’esatta tempistica dipende turnover proteico e l’efficacia del dsRNA. RNAi trattamenti più brevi 3 d vuotano efficacemente le cellule di determinate proteine, mentre altri obiettivi richiedono più trattamenti6. 3. produzione e raccolta di nebbia Scalare la crescita della S2:Fog-cellule Myc consentendo loro di crescere indisturbati per 4-8 d ottenere una boccetta confluenti 75 cm2 quasi il 100% delle cellule in 10 mL di terreno di coltura cellulare (o in alternativa, un pallone da 150 cm2 in 20 mL di terreno di coltura cellulare) a maxi Mize produzione di nebbia. Aggiungere 50 µ l di 100 mM CuSO4 (o 100 µ l di 100 mM di CuSO4 per un pallone da 150 cm2 ) nel matraccio quasi 100% confluenti 75 cm2 per l’induzione del promotore metallothionine. Incubare per 48 h a temperatura ambiente. Rimuovere il mezzo di nebbia-Myc-contenente nel matraccio di cultura del tessuto pipettando e trasferirlo in una provetta conica 15 mL o 50 mL. Centrifugare a 2.500 x g a 4 ° C per 10-15 min cancellare il medium delle cellule e detriti cellulari. Trasferire il mezzo di cella cancellata ad un nuovo tubo conico e mantenerla sul ghiaccio. Lavorare in batch, trasferire 5 mL di terreno liquidato a 15 mL di concentratori di 3.000 MW con membrane di cellulosa rigenerata e centrifugare a 2.500 x g a 4 ° C per 30 minuti alla volta, per concentrare il mezzo.Nota: In alternativa, un concentratore con una maggiore capacità di volume potrebbe essere usato (50 mL). Momento della concentrazione, un mezzo colorato più scuro, che è arricchito con nebbia, inizierà a costruire nella parte inferiore del filtro a forma di V. Inserire la punta della pipetta fino in fondo la “V” del concentratore e rimuovere il supporto colorato più scuro tra ogni round di centrifugazione e trasferirlo in una provetta di fresco 1,7 mL microfuge. Mantenere i media sul ghiaccio. Utilizzando il concentratore stesso, ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 rimuovendo il colore più scuro concentrano media di nebbia-Myc e sostituirlo con altro mezzo preadsorbito, fino a quando il mezzo è stato concentrato a 1/10 del suo volume originale (cioè, 1 mL da 10 mL di materiale di partenza). Memorizzare la nebbia-Myc concentrato a 4 ° C.Nota: Dopo il deposito, assicuratevi di controllare per contaminazione batterica, che può derivare da lunghi periodi di inattività. Eseguire SDS-PAGE mescolando 10 µ l di concentrato nebbia-Myc terreno con 10 µ l di un tampone contenente SDS denaturante per formare un lisato. Esegua il gel di SDS-PAGE 35 mA per circa 1 h. trasferire il gel su una membrana di nitrocellulosa (o in alternativa, una membrana PVDF) per 1 h a 120 mA. Eseguire un western blot utilizzando qualsiasi anticorpo di Myc commercialmente disponibile per rilevare una fascia di 150-kDa.Nota: La concentrazione di nebbia-Myc nel medium condizionato può variare per ogni batch. Non è necessario determinare l’esatta concentrazione di nebbia-Myc al fine di eseguire il test, ma l’efficacia di ciascuna partita deve essere testato prima di eseguire un esperimento. Seguente procedura 3.1-3.2, prepara il controllo supporti S2-condizionato attraverso la raccolta di 10 mL di terreno di coltura cellulare da una boccetta di quasi il 100% confluenti 75 cm2 di cellule S2 (o, in alternativa, 20 mL da una boccetta di 150 cm2 ) pipettando. Trasferire il controllo del mezzo di coltura cellulare di S2 in una nuova provetta conica 15 mL o 50 mL. Seguente procedura 3.4-3.7, deseleziona il lysate delle cellule e detriti cellulari mediante centrifugazione (a 2.500 x g a 4 ° C per 30 minuti alla volta) e poi trasferire la cella cancellata lisata di concentratori e centrifuga per concentrare il mezzo di controllo in lotti per 1/10th il volume originale.Nota: Applicazione dei media S2-condizionati non comporta contrattilità cellula notevole nel dosaggio. Conservare i supporti di controllo S2 concentrati a 4 ° C per diversi mesi.Nota: Dopo il deposito, assicuratevi di controllare per la contaminazione. 4. preparazione della concanavalina-A-coated piatti con fondo di vetro e la placcatura di S2R + cellule Fare 10 mL di concanavalina A (raggiro A) soluzione dissolvendo 5 mg di raggiro A in 10 mL di acqua per una concentrazione finale di 0,5 mg/mL. Aliquotare questa soluzione in volumi più conveniente (500 µ l a 1 mL) e conservare a-20 ° C. Preparare piatti con fondo di vetro 35mm rivestendo la porzione di vetro di ogni piatto con 200 µ l della soluzione di raggiro A e incubare i piatti per circa 2 min a temperatura ambiente in una cappa di coltura del tessuto. Successivamente, rimuovere tutti i con una soluzione (che possa essere conservata e riutilizzata per futuri esperimenti) e consentire i piatti asciugare completamente.Note: Piatti possono essere preparati in grandi lotti e possono essere memorizzati fino a 6 mesi in luogo asciutto come un cassetto del banco di laboratorio. Aggiungere circa 2 mL di terreno di coltura di cellule fresche ad ogni piatto con fondo di vetro. Risospendere le cellule S2R + a essere testato mediante il saggio pipettando medium della coltura cellulare su e giù, usando per staccare eventuali cellule senza bloccare aderente. Trasferire il sedimento S2R + cellule ai piatti 35 mm con fondo di vetro contenente il terreno di coltura di cellule fresche, in modo che essi sono tra i 50-70% confluenti. Controllare la densità delle cellule sotto il microscopio di coltura del tessuto di messa a fuoco su e giù attraverso diverse pianure delle cellule sospese nel mezzo per ottenere una stima del numero di cellule.Nota: Attraverso tentativi ed errori, la densità appropriata delle cellule necessarie raggiungere confluency di 50-70% può essere raggiunto. Permettono alle cellule di allegare ai piatti con fondo di vetro con A-rivestite per 45-60 min.Nota: S2R + cellule completamente allegate appaiono ‘fritto-uovo-like,’ appiattita e fase-scuro. 5. efficacia Test del mezzo nebbia-condizionato e il dosaggio di contrattilità cellulare Se desiderato, confermare il rendimento di nebbia-Myc prodotta e concentrato dalla S2:Fog-stabile di Myc cellule linee mediante SDS-PAGE e western blotting. Aggiungere 10 µ l di tampone contenente SDS a 10 µ l di concentrato nebbia-Myc e bollire per 5 min, seguire le standard SDS-PAGE e western blotting protocolli e macchia per anti–Myc confermare la produzione di nebbia-Myc. Rimuovere tutte le Shield e cantato M3 medio dal S2R + cellule allegate dal punto 4.3 pipettando delicatamente e con attenzione aggiungere retro 75 µ l di terreno nuovo scudo e Sang per limitare la quantità di nebbia-condizionato fluido utilizzato. Aggiungere 75 µ l di nebbia-condizionato media nella parte di vetro del piatto con fondo di vetro dal punto 5.2 per portare il volume totale a 150 µ l, con un rapporto di 1:1 di nebbia-condizionato media allo scudo e cantato M3 media.Nota: Un volume totale di 150-200 µ l è necessario per coprire interamente la parte di vetro di un piatto tipico con fondo di vetro; Tuttavia, questo dipenderà le dimensioni del piatto con fondo di vetro utilizzato. Monitorare la contrattilità delle cellule da microscopia di contrasto di fase usando X 20 o 40 ingrandimenti per osservare un intero campo di cellule. Traccia la morfologia delle cellule e cercare l’alternarsi di fase scuro e luce fase scompigliava indicativo del cambiamento di forma.Nota: L’applicazione di nebbia in genere conduce a 30-50% delle cellule S2R + in fase di riduzione cellulare, e dopo 10 min, le cellule cominciano a rilassarsi, tornando alla loro morfologia liscio-orlato, fritto-uovo-come. Monitorare la robustezza della contrattilità cellulare. Se la risposta delle cellule è molto forte utilizzando un rapporto di 1:1 di nebbia-condizionato medio-mezzo scudo e Sang fresco, ridurre la quantità di nebbia-condizionato mezzo per conservare il mezzo di nebbia-Myc concentrato per gli esperimenti futuri. Utilizzare non diluito mezzo di nebbia-condizionato se un rapporto di 1:1 non porta alla costrizione cellulare robusto; in generale, un rapporto di 1:3 produce abbastanza risposta a portare a termine l’esperimento.Nota: Una volta il rapporto appropriato di nebbia-condizionato medio-mezzo scudo e Sang fresco è stabilito al dato lotto di nebbia-condizionato medio, è possibile utilizzare questo rapporto per tutti gli altri esperimenti. Monitorare non muscolo-miosina II dinamiche durante il dosaggio di contrattilità cellulare utilizzando la linea di cella S2R + stabile che esprime GFP-etichettato catena chiara regolamentazione (S2R +: Sqh-EGFP). Utilizzando il rapporto stabilito di nebbia-condizionato medium per mezzo scudo e cantato M3 fresco da passaggi 5.2-5.5, rimuovere il mezzo di coltura cellulare con una pipetta e aggiungere mezzo scudo e Sang torna fresco nella parte di vetro del piatto con fondo di vetro. Irrorare medie nebbia-condizionato al rapporto predeterminato durante l’acquisizione di una sequenza di immagini di cellule vive; fare attenzione a non spostare il piatto con fondo di vetro durante la perfusione. 6. fissaggio e colorazione delle cellule ristretto S2R + Difficoltà S2R + cellule usando una soluzione di paraformaldeide 10% in tampone PEM (tubi di 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).Nota: PEM buffer viene solitamente fatta a 2x soluzione di riserva e può essere conservato per mesi a 4 ° C. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare da nebbia-trattati S2R + cellule pipettando e sostituirlo immediatamente con 1,5-2,0 mL di soluzione di 10% paraformaldeide. Incubare per 15 min a temperatura ambiente.Nota: Celle fisse possono essere memorizzate nella soluzione di fissaggio a 4 ° C per diversi giorni; Tuttavia, è importante che la fissazione di 15 min iniziale avviene a temperatura ambiente prima di trasferire le cellule a 4 ° C. Rimuovere la soluzione di 10% paraformaldeide pipettando e smaltire questo prodotto di rifiuti organico. Sciacquare le cellule pipettando delicatamente 1,5-2,0 mL di tampone fosfato salino (PBS) per il 35 mm con fondo di vetro piatto. Rimuovere il vecchio PBS pipettando e sostituirlo con 1.5-2.0 mL di PBS fresco 2 x altro per rimuovere la soluzione residua fissazione.Nota: È importante che le cellule non seccano da questo punto il nel protocollo. Bloccare le cellule con circa 200 µ l di siero di capra normale 5% diluito in PBS che è stato integrato con 0,1% detergente non ionico (PBST) per 20 min a temperatura ambiente.Nota: In genere, soluzioni di blocchi contengono siero che corrisponde all’organismo in che gli anticorpi secondari vengono generati. Preparare la soluzione di anticorpo primario di diluirla in PBST. Utilizzare un volume di circa 200 µ l per coprire completamente la parte di vetro del piatto con fondo di vetro. Rimuovere la soluzione bloccante pipettando e aggiungere la soluzione di anticorpo primario direttamente nella parte di vetro del piatto. Incubare per 1 h a temperatura ambiente o, in alternativa, incubare per una notte a 4 ° C. Quando incubazione overnight a 4 ° C, avvolgere il 35mm con fondo di vetro piatto con parafilm per evitare l’evaporazione. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario pipettando e sciacquare le cellule di pipettaggio 1.5-2.0 mL di PBS fresco al piatto con fondo di vetro 35mm. Rimuovere PBS pipettando e sostituirlo con 1,5-2,0 mL di PBS fresco 2 x altro. Preparare una soluzione di anticorpo secondario di diluirla in PBST. Un volume di 200 µ l è adeguato per coprire solo la parte di vetro del piatto. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario direttamente nella parte di vetro del piatto. Incubare le cellule con soluzione di anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. Avvolgere il piatto di 35mm con parafilm se incubando durante la notte, per evitare l’evaporazione. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario pipettando e sciacquare le cellule con PBS di pipettaggio 1.5-2.0 mL di PBS fresco al piatto. Rimuovere il vecchio PBS e sostituirlo 2 volte, seguendo la stessa procedura. Conservare le cellule fisse e macchiate aggiungendo abbastanza di un mezzo di montaggio fluorescente antislittamento per coprire la parte di vetro del piatto 35mm con fondo di vetro. Conservare i campioni a 4 ° C e lontano dalla luce.Nota: Il segnale fluorescente lentamente decadranno nei mesi anche se correttamente conservato. Per ottenere risultati ottimali, immagine entro una settimana. 7. imaging e quantificazione del dosaggio contrattilità cellulare Immagine fissata S2R + cellule utilizzando uno standard luce microscopio con contrasto di fase, DIC o funzionalità di imaging di fluorescenza invertito. Utilizzando X 20 o 40 ingrandimenti, catturare 10-30 campi di immagine non sovrapposte delle cellule a seconda della densità delle cellule, con l’obiettivo di acquisire le immagini di 200 o più cellule per condizione. Utilizzando un contatore di cella standard, contare e registrare il numero di contrattuale (cellule di fase-dark, cofano motore) e cellule noncontracted per ogni campo catturato.Nota: È meglio avere due ricercatori assumere indipendenti conteggi delle cellule contratte e noncontracted al campo, o in alternativa, il ricercatore stesso può contare lo stesso campo di immagine delle cellule tre volte, consentendo un numero medio di contratta e noncontracted cellule per campo deve essere calcolato. Preparare diversi piatti con-A-rivestito con fondo di vetro per condizione sperimentale come descritto al punto 4.2. Pipettare su e giù per il mezzo di coltura cellulare sloggiare qualsiasi cellule S2R +: Sqh-EGFP vagamente aderenti e impiattatelo quindi sono 50-70% confluenti in piatti con fondo di vetro 35mm. Permettono alle cellule di allegare per 30-45 minuti. Immagine il S2R +: Sqh-EGFP celle dal vivo utilizzando un microscopio confocale disco rotante, campo spazzato o microscopia luce-foglio utilizzando 60 X – 100 ingrandimenti. Rimuovere tutte le Shield e cantato M3 medio dal piatto con fondo di vetro contenenti cellule S2R +: Sqh-EGFP allegate. Irrorare il rapporto predeterminato del medium condizionato di nebbia-Myc al fresco mezzo scudo e cantato M3 da passaggi 5.2-5.5 direttamente sulla parte di vetro del piatto con fondo di vetro utilizzando una pipetta, attenzione a come per non disturbare la posizione del piatto sull’obiettivo. Acquisizione di immagini per 12-15 min al fine di catturare l’iniziazione e la piena contrazione delle cellule S2R +: Sqh-EGFP.Nota: Se la macchiatura per miosina non-muscolare o miosina-pRLC, la formazione di un anello stretto della miosina sulla superficie delle cellule è anche indicativa della contrattilità. Se cellule S2R +: Sqh-EGFP live, RLC EGFP-etichetta formerà simili stretto di imaging anelli (Vedi Figura 3) indicativo di contrattilità. Il cambiamento di forma che si verifica causerà le cellule a “cofano”, riprendendo la forma 3D; il piano di messa a fuoco del microscopio potrebbe essere necessario essere regolata per tenere traccia di questo cambiamento di forma delle cellule. Sotto condizioni di RNAi di controllo, in genere, 30-50% delle cellule subiscono costrizione sull’aggiunta di nebbia. Essere consapevoli che alcune condizioni di RNAi possono portare alla costrizione in assenza di nebbia.

Representative Results

S2 e S2:Fog-Myc cellule sono state coltivate per vicino a condizioni confluenti in un matraccio di cultura del tessuto 150 cm2 e sono state trattate con 25-75 µM CuSO4 per un periodo di 24-48 ore di indurre l’espressione di nebbia-Myc (Figura 2). Campioni da cellule S2 (Figura 2A) e S2:Fog-cellule Myc (Figura 2B) sono stati rimossi e la produzione di nebbia-Myc è stata monitorata mediante western blot. Come previsto, siamo riusciti a rilevare nebbia-Myc nei media raccolte dalle cellule S2 in qualsiasi condizione. Tuttavia, abbiamo rilevato nebbia nei media raccolti dalla S2:Fog-Myc stabile di cellula più presto 24 ore dopo l’induzione con 75 µM CuSO4. S2R + cellule allegate ai piatti con fondo di vetro con-A-coated esprimendo un’etichetta EGFP regolamentazione catena leggera (GFP-RLC) non muscolo-miosina II (figure 3A e 3B). Cellule vive imaging è stata eseguita su un microscopio invertito con un 100 X / 1,4 NA lente dell’obiettivo durante la perfusione dei media di nebbia-condizionati. Circa 5 minuti dopo trattamento con nebbia-Myc, RLC forma anelli indicativi di costrizione II della miosina non-muscolare. Questi anelli possono essere osservati attraverso immunostaining S2R + cellule con un anticorpo alzato contro un fosfopeptide sintetica corrispondono ai residui che circondano Ser19 umano miosina RLC (figure 4A e 4B). Questo anticorpo traversa-reagisce con Drosophila RLC. Qui abbiamo un esempio rappresentativo del dosaggio contrattilità cellulare seguendo un trattamento di 7 giorni delle cellule con controllo RNAi e dsRNA contro Rho1 (figure 5A – 5E). S2R + cellule erano cromate con-A-coated piatti con fondo di vetro e trattata con nebbia-condizionato (+ nebbia) media o media di controllo (-nebbia). Il numero di celle contratte quindi sono stato quantificato a seguito di fissazione. Fase densa volant indicativo della costrizione era prominente in cellule di controllo impoverito trattate con nebbia-condizionato media (Figura 5B). Nella Figura 5C, Rho-vuotati cellule trattate con il mezzo di S2-condizionate sono un tipico esempio di liscio-orlato, fritto-uovo-come morfologia. Si noti che Rho svolge un ruolo nella via di segnalazione di nebbia, così come nella citochinesi; quindi, cellule Rho-vuotati spesso non riescono a dividere correttamente, portando ad un aumento nel formato delle cellule e ploidia. Trattamento di controllo impoverite cellule con nebbia-condizionato media tipica conduce al 30% – 50% delle cellule che subiscono la costrizione, considerando che non siamo riusciti a osservare la sostanza riduzione nelle cellule Rho-vuotati. Figura 1:la nebbia putativa via di segnalazione. In assenza di nebbia, la subunità Gα12/13 , Concertina (Cta), insieme ai suoi partner di associazione Gϒ e Gβ, sono inattivi e associati con i co-recettori nebbia e Smog. Ric-8 chaperoni Cta e regola la sua localizzazione subcellulare. Al momento di nebbia vincolanti, Cta dissocia da Gϒ e Gβ reclute RhoGEF2 alla membrana cellulare dove catalizza lo scambio di PIL per GTP nel piccolo GTPase Rho1. GTP-associazione Rho1, ora attivo, attiva la chinasi Rho (Rok), che fosforila RLC della miosina non-muscolare, che porta alla sua attivazione e la successiva contrattilità cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Corso di tempo di produzione di nebbia-Myc. Questi pannelli mostrano medium di coltura cellulare, raccolte da una boccetta confluenti di vicino 100% delle cellule di controllo S2 (A) o (B) S2:Fog-cellule stabili Myc. Le cellule sono state trattate con 25-75 µM CuSO4 per un periodo di 24-48 ore. Il terreno di coltura cellulare era raccolto e preparato per SDS-PAGE e western blotting. Nebbia-Myc è stata rilevata da un anticorpo anti–Myc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Formazione immagine di cellule vive di riduzione indotta da nebbia. Stabile S2R + linee cellulari che esprimono EGFP-etichetta RLC non muscolo-miosina II erano imaged mediante microscopia confocale spazzato-campo durante la perfusione dei media di nebbia-condizionati. Ora è indicata in minuti e secondi. (A), questo pannello mostra l’immagine di un piano focale vicino l’interfaccia cella-coprioggetto al tempo 0:00 prima la perfusione di nebbia-Myc. (B), questo pannello presenta una serie temporale (0:30-10:00) di immagini prese a un piano focale nella parte superiore della cella. Le frecce bianche indicano la riorganizzazione della miosina non-muscolare II come indicato da EGFP-RLC in anelli contrattili durante la costrizione. La barra della scala è 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : RLC fosforilata si localizza anelli contrattili dopo induzione della costrizione di nebbia-Myc. S2R + cellule erano fissi e macchiate per actina mediante falloidina (rosso), fosforilato RLC usando un anticorpo di fosfoserina-19 (verde) e DAPI (DNA, blu), a seguito del trattamento con controllo (A) o (B) media di nebbia-Myc-condizionato. Si noti la riorganizzazione di RLC fosforilata ad anelli sull’aggiunta di nebbia-Myc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Quantificazione rappresentativa del dosaggio contrattilità cellulare indotta da nebbia. S2R + cellule sono state trattate con (A e B) controllo RNAi o dsRNA (C e D) contro il piccolo GTPase Rho1 per 7 giorni. Dopo questo tempo, le cellule erano cromate con-A-coated piatti con fondo di vetro e sono state trattate con mezzi di controllo (A e C) o (B e D) mezzi di nebbia-Myc-condizionato. Della barra rappresenta 10 µm. (E) A dispersione della scala indica gli intervalli di confidenza 95% e media della frazione di cellule contratte per condizione. Singoli punti rappresentano la frazione di cellule contratte per campo visivo a 40 ingrandimenti (10-120 cellule per campo) e i numeri tra parentesi indicano che il numero totale di cellule contate per cellule contratte e non convenzionati oltre tre diversi Esperimenti di RNAi. Gli asterischi indicano una differenza statisticamente significativa tra nebbia-trattato e di RNAi – condizioni, come determinato da One-way ANOVA (p < 0.0001) con analisi di post hoc, confronto multipla di Tukey. Si noti che non c’era differenza statisticamente significativa (n.s.) tra Rho1 RNAi-trattati campioni trattati con controllo o con media di nebbia-Myc-condizionato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per un’analisi di contrattilità basati su cellule usando una linea di cellulare di coltura del tessuto di Drosophila (S2R + cellule), che subisce la costrizione II della miosina non-muscolare come risposta alla nebbia di segnalazione. Questo test è utile per investigare la via di nebbia, come pure i meccanismi che regolano la contrattilità II della miosina non-muscolare.

Considerazioni di coltura delle cellule:
Le condizioni in cui S2R + cellule vengono gestite è fondamentale per ottenere dati affidabili da questo test. Quando si intende eseguire l’analisi di contrattilità, e ‘ meglio mantenere le cellule S2R + Mezzo insetto scudo e cantato M3. Mentre S2R + cellule possono prosperare in altri terreni di coltura delle cellule di insetto (per esempio, SF900 o di Schneider medio dell’insetto), perdono spesso la loro reattività alla nebbia. S2R + cellule che hanno un numero di passaggio alto, generalmente più di 20-25 passaggi, cominciano a perdere la sensibilità di RNAi. Si consiglia di utilizzare cellule precoce passaggio per tutti gli esperimenti. Un altro aspetto importante per gli esperimenti di RNAi deplezione sta scegliendo controlli appropriati. Controlli negativi comuni includono dsRNA targeting EGFP o pBlueScript, né di che hanno omologia al genoma volo. Targeting per proteine nella via della nebbia (Rho, Rok, ecc.), che, una volta vuotato, impedire l’attivazione della contrattilità della miosina non muscolare, sono anche utili controlli. S2:Fog-cellule Myc possono essere mantenute in un terreno di coltura cellulare alternativi come SF900 completati con 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, e 0,25 amfotericina B. nota che FB è non necessario quando la coltura delle cellule in SF900. Densità delle cellule è anche una componente critica per tutti gli aspetti delle cellule di coltura del tessuto della drosofila . A differenza delle cellule dei mammiferi, Drosophila-cellule derivate prosperano il più bene sotto maggiore densità delle cellule (densità non inferiore a 5 x 105 cellule/mL). Tuttavia, quando si esegue questo test, è fondamentale che le cellule non sono placcate con-A-rivestito di piatti con fondo di vetro sopra la confluenza di 80%, come la quantificazione delle cellule contratta contro non convenzionati diventerà estremamente noiosa.

Aspetti critici e approcci alternativi del dosaggio contrattilità cellulare:
La produzione di nebbia, il ligando che innesca la contrattilità di non muscolo-miosina II, è un componente chiave di questo test. Il nebbia gene codifica per una proteina di 730 aminoacidi con un peso molecolare previsto di ~ 78 kDa26. L’analisi hydropathy ha rivelato un tratto di 12 residui idrofobi al amminico-terminale di nebbia che potesse funzionare come una sequenza di segnale di secrezione. Inoltre, la sequenza di codificazione contiene anche più siti per potenziale N – e O-collegata della glicosilazione, suggerendo ulteriormente che la nebbia è una proteina secreta26. A sostegno di ciò, la nebbia è stato localizzato a vescicole secretorie in cellule epidermiche presuntiva in fase di costrizione apicale16. Espressione di nebbia-Myc è stata indotta con l’aggiunta di solfato di rame al mezzo, e gli anticorpi contro nebbia o Myc riconosciuto una proteina 150-kD da terreno di coltura raccolto da colture indotte ma non da indotta media dalle cellule S2 manca il costrutto di nebbia-Myc. Questo peso molecolare era superiore al peso molecolare di 80-kD previsto di nebbia e suggerisce che il meccanismo secretivo delle cellule S2 può glicosilare la proteina prima di esocitosi. A causa della variabilità potenziale nella purificazione di nebbia, si consiglia di utilizzare lo stesso batch di nebbia-condizionato media per tutti gli esperimenti. Che compongono grandi lotti di concentrazione media di nebbia-Myc vi aiuterà a mantenere uniformità tra i turni degli esperimenti.

Il successo di questo test dipende anche con fiducia che identifica le cellule che hanno subito la costrizione. Mentre cellule ristrette possono essere osservate mediante microscopia a fluorescenza, macchiando per actina o non muscolo-miosina II, il modo più affidabile per identificare e quantificare le cellule ristrette è attraverso il contrasto di fase o microscopia DIC. Conteggi precisi possono essere raggiunto utilizzando 20x – 40x sulla maggior parte dei microscopi ottici. Sebbene il protocollo scritto qui usa piatti con fondo di vetro, il dosaggio può essere eseguito anche utilizzando standard 1,5 vetrini coprioggetti, rivestiti con con A. L’aggiunta di nebbia può essere fatto in 35 mm della coltura del tessuto su un vetrino coprioggetti immesso sul parafilm, al fine di limitare la quantità di nebbia utilizzato per ogni dosaggio. La qualità della fissazione è un componente critico del test, come cellule scarsamente fisse possono portare a falsi positivi. Soluzione di fissazione fresco e assicurandosi che le cellule mai asciutto una volta fissate porterà a risultati più affidabili. Infine, è importante contare un numero elevato di celle. In genere, solo il 30-50% di non trattata o cellule di RNAi-trattati di controllo si restringono in seguito la perfusione di nebbia. Tuttavia, c’è un livello basale di costrizione che si verifica in cellule di S2R +, quindi un gran numero di cellule è necessaria per garantire qualsiasi cambiamento nella frazione di cellule ristrette è a causa di trattamenti. Inoltre, lo svuotamento di alcune proteine coinvolte nella regolazione della contrattilità II della miosina non-muscolare può portare a iper-contrattilità, anche in assenza di nebbia. I dati presentati qui sono da oltre 3.600 cellule che sono stati contati in tre successivi trattamenti di RNAi utilizzando lo stesso batch di media di nebbia-condizionato.

Applicazioni del dosaggio contrattilità cellulare:
Questo test di contrattilità, quando accoppiato con RNAi, i metodi di screening offre un potente sistema per studiare segnalazione delle cellule, la morfogenesi e la contrattilità cellulare. In precedenza, esso è stato utilizzato per identificare uno dei due co-recettori di nebbia21. Uno schermo mirato di 138 recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è vuotato di RNAi in cellule di S2R +, e la capacità di rispondere alla nebbia è stata analizzata come descritto nel protocollo presentato qui. Dei 138 GPCR, un unico gene precedentemente atipici, ora conosciuto come nebbia, è stato scoperto. L’indagine successiva nella funzione di nebbia ha dimostrato che non solo era esso richiesto per contrattilità cellulare indotta da nebbia in cellule S2R +, ma era inoltre essenziale per gastrulazione nello sviluppo della drosofila21. Inoltre, questa analisi è stata usata per dimostrare che Ric-8, un GEF non canonico, è anche un componente nella nebbia signaling pathway27. Una serie di esperimenti di RNAi epistasi accoppiato con il dosaggio di contrattilità ha dimostrato che Ric-8 interagisce con le subunità Gα12/13 Cta e funzioni per localizzarlo all’interno della cellula, che è fondamentale per la contrattilità cellulare indotta da nebbia31 .

Coltura del tessuto della drosofila è adatto ai novizi, come le cellule sono facilmente mantenute a temperatura ambiente, non necessitano di CO2 o tamponata medium della coltura cellulare e sono robuste come densità di cultura adeguata delle cellule sono mantenuti. Il dosaggio di contrattilità cellulare è stato effettuato con successo dalla sezione del laboratorio di un corso di biologia cellulare dello studente non laureato, dove gli studenti hanno non avuto poca o nessuna esperienza con cellule di coltura o microscopia. Il dosaggio di contrattilità cellulare qui presentato rappresenta uno strumento potente, basata sulle celle che possa essere impiegato in gene scoperto, o per interrogare la nebbia via di segnalazione, ci aiuta a meglio comprendere processi inerenti allo sviluppo, come la costrizione apicale e contrattilità di non muscolo-miosina II, in generale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio Rogers e il laboratorio di Applewhite, Greta Glover e gli studenti in corso di biologia cellulare del Reed College primavera 2018, che hanno contribuito allo sviluppo di questo protocollo. Inoltre, gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio Ritz per attentamente leggere e modificare questo manoscritto. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla National Science Foundation sotto numero di premio 716964 D.A.A. e A.R. e al dipartimento di biologia di Reed College.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
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