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Developmental Biology

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Hier beschreiben wir einen Kontraktilität Assay mit Drosophila S2R + Zellen. Die Anwendung einer exogenen Liganden, gefalteten Gastrulation (Nebel), führt zur Aktivierung des Nebels weg und zellulären Kontraktilität-Signalisierung. Dieser Test kann verwendet werden, um die Regulierung der zellulären Kontraktilität Proteine im Signalweg Nebel zu untersuchen.

Abstract

Wir haben eine zellbasierte Assays mit Drosophila -Zellen entwickelt, die apikale Verengung initiierten gefalteten Gastrulation (Nebel), ein sekretierten epithelialen gestaltbildenden rekapituliert. In diesem Test wird Nebel als Agonist verwendet, um Rho durch eine Signalkaskade zu aktivieren, die einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (Nebel), ein Gα-12/13 -Protein (Konzertina/Cta) und ein PDZ-Domänen-haltigen Guanin-Nukleotid Exchange Faktor (RhoGEF2) enthält. Nebel, die Ergebnisse in der schnellen und dramatischen Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts bilden eine KONTRAKTILE Geldbörse Zeichenfolge signalisieren. Lösliche Nebel ist eine stabile Zelllinie abgeholt und ectopically auf S2R + Zellen, führt zu morphologischen Veränderungen wie apikalen Verengung, ein Prozess zu beobachten, während Entwicklungsprozesse wie Gastrulation angewendet. Dieser Assay ist zugänglicher Hochdurchsatz-Screening und mit RNAi, kann die Identifizierung von zusätzlichen Genen, die in diesen Weg erleichtern.

Introduction

Studien der Embryogenese genetische Modellorganismen durchgeführt haben bewiesen von unschätzbarem Wert für unser Verständnis der wie Zellen zu Geweben zusammengesetzt werden. Studien von Drosophila Melanogaster, führten insbesondere die Identifizierung von schlüsselgene und biologische Prinzipien, die die Morphogenese leiten und Entwicklung von Organismen von der Befruchtung bis ins Erwachsenenalter1,2 , 3. parallel zu den genetischen Forschungen mit Drosophila, kultivierten Zelllinien aus Fruchtfliege Gewebe entstanden auch als ein leistungsfähiges System, ein breites Spektrum von molekularen und Zelle biologische Fragen4, 5 , 6. Drosophila Gewebekultur Zellen haben minimale Anforderungen für die Wartung, da sie kultivierten bei Raumtemperatur und ohne CO2. Als solche sind sie offen für hochauflösende Bildgebung, und sie haben eine hohe Anfälligkeit für gen-Hemmung durch RNAi6,7. Viele Gruppen haben Drosophila Gewebekultur Zellen als Werkzeug benutzt, um Gene, die bei der Festlegung der Zellform, Zellskelett Dynamik, Rentabilität, Phagozytose und Signal Transduction Bahnen4,8zu entdecken, 9,10,11. Wenn als Modell neben das ganze Tier beschäftigt, bieten kultivierte Drosophila -Zell-Linien eine Reihe von sehr komplementäre Ansätze, die die Identifizierung von Molekülen, die wichtig für die Entwicklung zu beschleunigen und einen Rahmen, um bestimmen Sie ihre mechanistischen Rollen12. Hier beschreiben wir eine zellbasierte Assays um die Signalwege zu studieren, die apikale Verengung über gefaltet Gastrulation (Nebel) Weg13,14auslösen. Kontraktilität zellbasierte Assays kann Forscher untersuchen sowohl der Nebel Signalisierung Weg und die molekularen Mechanismen, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität regulieren.

Gastrulation des frühen Embryos von Drosophila ist seit vielen Jahren als genetische Vorbild für die epithelialen Morphogenese und der zellulären Übergang von epitheliale Mesenchymale Zellen Identität untersucht worden. Eines der wichtigsten Ereignisse der Gastrulation ist die Morphogenese einer Teilmenge von epithelialen Zellen entlang der embryonalen ventralen Mittellinie von säulenförmigen, pyramidale Form15,16,17,18. Diese einfache Zellform Änderung führt zu die Internalisierung der mutmaßlichen mesodermalen Zellen und wird angetrieben von der motorischen Aktivität der nicht-Muskel Myosin II einengenden Aktin Netzwerk16,19,20. Jahrzehnte der Genforschung hat die molekularen Bestandteile dieser Signalweg identifiziert und hat gegenüber dem Vorquartal legte sie in der folgenden Reihenfolge: 1) Nebel wird abgesondert von der apikalen Domäne der epithelialen Zellen an der ventralen Mittellinie; (2) Nebel bindet an die G-Protein-gekoppelten Co-Rezeptoren, Nebel und Smog, und signalisiert durch eine Heterotrimeric G-Protein Komplex mit der Gα-12/13 -Untereinheit Konzertina (Cta), die von der nicht-kanonischen GEF Ric-8 begleitet ist; (3) Cta aktiviert einen Guanin-Nukleotid Austausch Faktor, RhoGEF2, die wiederum die kleinen G-Protein-Rho1 aktiviert; (4) Rho1 aktiviert Rho-Kinase (Rok); (5) Rok aktiviert-Muskel Myosin II Kontraktilität der apikalen Domäne durch Phosphorylierung des regulatorischen Leichtketten (RLC), wodurch apikalen Verengung (Abbildung 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationen in mehreren dieser Komponenten stören die normale Gastrulation und anderen morphogenetischen Bewegungen, einschließlich der Bildung der Flügel Scheibe und Speicheldrüsen, darauf hinweist, dass dieser Weg in mehreren Stadien von Drosophila verwendet wird Embryogenese30,31,32. Der Nebel Weg ist eines der am besten untersuchten Modelle für die Gestaltung der epithelialen und lieferte wichtige Erkenntnisse wie Gewebe-Ebene Morphogenese wird geregelt von Gentranskription Zelle cytoskelett-gesteuerte Bewegungen14,15 ,21.

Wir entwickelten einen zellbasierte Kontraktilität-Assay, der viele von den zellulären Reaktionen flussabwärts der Nebel rekapituliert, die bei der Entwicklung von Fly Embryonen17beobachtet wurden. Wir entwickelten eine stabile S2 Zelllinie, die Nebel drückt in seiner C-Terminus mit Myc unter der Kontrolle eines induzierbaren Metallothionine Promotors markiert, die auf den Zusatz von Kupfersulfat (CuSO4) auf das Medium geerntet werden kann. Wenn Nebel bedingt Medien ectopically auf S2 Rezeptoren + (S2R) Zellen,, die eine Subline der S2-Zellen zeichnen sich durch ihre differentielle Expression der Rezeptoren wie Frizzled und Integrin-Untereinheiten angewendet werden, die Zellen durchlaufen eine Reorganisation der Zytoskelett erinnert stark von apikalen Verengung12,17,27,33. Diese Veränderungen können beobachtet werden, indem Phasenkontrast-Mikroskopie in dem Nebel Behandlung führt zum Auftreten von Phase-dunkel Rüschen bezeichnend für eine Erhöhung der radialen in nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität oder Fluoreszenz-Mikroskopie, wo Nebel Behandlung führt zu, den Bildung von nicht-Muskel Myosin II Ringe in Zellen EGFP getaggt RLC34zum Ausdruck zu bringen. Diese Ringe enthalten ein Myosin-phosphoryliert regulatorische leichte Kette (Missbrauchsfälle) sichtbar über Immunostaining23,34,35. Dieser Nebel-induzierte Reaktion erforderlich Cta, RhoGEF2, Rho und Rok; mit rekombinanten Nebel-Myc und S2R +-Zellen, haben wir somit ein Mittel zur Untersuchung von Nebel-induzierte Verengung in einem Gewebe-Kultur-basiertes System24,25,34etabliert.

Protocol

1. Wartung von Drosophila Gewebekultur Zellen Pflegen Sie S2R +, S2R +: RLC-EGFP und S2:Fog-Myc Zellen bei Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 20 ° C und 25 ° C, im Schild und Sang M3 Insekt Medium ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 Amphotericin B bei einer Dichte nicht niedriger als 5 x 105 Zellen/mL.Hinweis: Die untere Zelldichten zum Tod führen. Schnell tauen Sie Cryo erhaltenen Fläschchen von Zellen auf und übertragen Sie sie in einer Gewebekultur-Kolben. Beginnen Sie mit einem kleinen Gewebekultur Kolben (12,5 cm2 oder 25 cm2) in einem Volumen von ca. 4-5 mL Zellkulturmedium bis der Kultur etabliert und Anzeichen von Zelltod durch Auftauen abgeklungen.Hinweis: Zeichen der Zelltod durch Auftauen sind nicht anhaftende Zellen, die eine glatte, abgerundete Form und kleine dunkle Stückchen zelltrümmer in der Gewebekultur mittlere Indikativ des nekrotischen Zellen fehlt. Dadurch, dass die Zellen wachsen ungestört über mehrere Tage (4-8 d) zu 100 % Konfluenz, wo gibt es wenig bis gar kein Platz zwischen den Zellen und sie fangen an, aufeinander stapeln sich skalieren Sie langsam die Größe der Gewebekultur. Übertragen Sie alle Zellen von dieser 100 % konfluierende kleiner 12,5 cm2 oder 25 cm2 Fläschchen auf eine größere Gewebekultur Flasche (75 cm2) ergänzt mit 10 mL Zellkulturmedium.Hinweis: Aufrechterhaltung der Zellen in einem 75-cm2 Kolben erbringt genügend Zellen für die meisten Experimente. Die Passage der Zellen alle 3-4-d durch pipettieren Zellkulturmedium rauf und runter, benutzen, um alle Lose eingehalten Zellen aus der Gewebekultur Kunststoff zu verdrängen. Übertragen Sie dieses Medium jetzt die resuspendierte Zellen in eine frische Flasche enthält. Verdünnen Sie der Zellen 1:4 mit Frischzellen-Kulturmedium mit jedem Durchgang und nach Bedarf zu wiederholen. (2) RNAi Behandlung von Drosophila S2R + Zellen Hinweis: Beziehen sich auf Rogers und Rogers6 für detaillierte Anweisungen zum DsRNA geeignet für Insekten Kultur zu produzieren. Übertragen Sie S2R +-Zellen auf eine 6-Well oder 12-Well-Zellkultur-Platte in einer Dichte, die förderlich für die Lebensfähigkeit, kein geringer als 5 x 105 Zellen/mL, mit kompletten Schild und Sang M3 Nährmedien für RNAi Behandlungen Zelle. Arbeiten in einer Gewebekultur-Haube, Entfernen der alten Zellkulturmedium durch sanft Kippen der Gewebekultur 6-Well oder 12-Well-Platte und das Zellkulturmedium mit einer Pipette absaugen. Ersetzen Sie schnell diese alten Zellkulturmedium mit 1 mL Kulturmedium Frischzellen durch in jede Vertiefung pipettieren.Hinweis: Dies kann ohne erheblichen Verlust erfolgen nach die Zellen sich locker für 30-45 min vor dem Austausch der Zellkulturmedium halten konnten. Fügen Sie 10 µg/mL DsRNA, die generiert wurde nach der detaillierten Protokolls in Rogers und Rogers6 durch pipettieren sie direkt in das Gewebe Kulturmedium von jedem gut von den Zellen pro RNAi Zustand. Wiederholen Sie diesen Vorgang täglich 1 mL frisches Medium und 10 µg/mL DsRNA pro RNAi Zustand das Zellkulturmedium ersetzen.Hinweis: RNAi Experimente sind in der Regel für 7D durchgeführt; der genaue Zeitpunkt ist jedoch abhängig von Protein-Umsatz und Wirksamkeit der DsRNA. RNAi Behandlungen so kurz wie 3-d zu einem Abbau effektiv Zellen bestimmter Proteine, während andere Ziele längere Behandlungen6 erfordern. (3) Nebel Produktion und Ernte Scale-up das Wachstum der S2:Fog-Myc Zellen dadurch, dass sie ungestört für 4-8 d zu einer fast 100 % konfluierende 75 cm2 Fläschchen der Zellen in 10 mL Zelle Kulturmedium (oder alternativ ein 150 cm2 Fläschchen in 20 mL Zellkulturmedium) bis Maxi wachsen Mize Nebel Produktion. Fügen Sie 50 µL 100 mM CuSO4 (bzw. 100 µL 100 mm CuSO4 für ein 150 cm2 Fläschchen) in den fast 100 % konfluierende 75 cm2 Kolben für die Induktion des Veranstalters Metallothionine. 48 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Nebel-Myc-haltigen Medium aus der Gewebekultur-Flasche durch pipettieren und auf eine 15 mL oder 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie bei 2.500 X g bei 4 ° C für 10-15 min, das Medium der Zellen und zelltrümmer zu löschen. Das geräumte Zelle Medium auf eine neue konische Rohr übertragen und auf dem Eis zu erhalten. Arbeiten in Chargen, übertragen Sie 5 mL des Mediums gerodeten 15 ml von 3.000 MW-Konzentratoren mit regenerierte Zellulose-Membranen und Zentrifugieren Sie es bei 2.500 X g bei 4 ° C für 30 min in einer Zeit, das Medium zu konzentrieren.Hinweis: Alternativ könnte ein Konzentrator mit einem größeren Fassungsvermögen verwendet (50 mL). Während der Konzentration startet ein dunkler gefärbten Medium, das mit Nebel angereichert ist, am unteren Rand der v-förmigen Filter aufbauen. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE an der Unterseite des “V” des Konzentrators und entfernen Sie die dunkleren farbigen Medien zwischen jeder Runde der Zentrifugation und auf einem frischen 1,7 mL Microfuge Rohr übertragen. Pflegen Sie die Medien auf dem Eis. Mit der gleichen Konzentrator, wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 durch das Entfernen der dunkleren farbigen konzentriert, Nebel-Myc Medien und ersetzt sie durch mehr precleared Medium, bis das Medium auf 1 wurde/10 des ursprünglichen Volumens (d.h. 1 mL von 10 mL Ausgangsmaterial). Lagern Sie die konzentrierte Nebel-Myc bei 4 ° cHinweis: Nach der Lagerung unbedingt für bakterielle Kontamination zu überwachen, die durch längere Lagerung entstehen. Führen Sie SDS-PAGE durch das Mischen von 10 µL konzentrierter Nebel-Myc Medium mit 10 µL eines denaturierenden SDS-haltigen Puffers ein lysate zu bilden. Führen Sie die SDS-PAGE-Gel bei 35 mA für ca. 1 h. übertragen Sie das Gel auf eine Nitrocellulose-Membran (oder alternativ eine PVDF-Membran) für 1 h bei 120 mA. Führen Sie ein western-Blot mit jeder handelsüblichen Myc-Antikörper um eine 150-kDa-Band zu erkennen.Hinweis: Nebel-Myc-Konzentration in der konditionierten Medium variieren pro Charge. Es ist nicht notwendig, die genaue Konzentration der Nebel-Myc zu bestimmen, um den Test durchzuführen, aber die Wirksamkeit von jeder Charge sollte getestet werden, bevor Sie ein Experiment durchführen. Folgenden Schritte 3.1-3.2, bereiten das Steuerelement S2 konditioniertes Medien durch das Sammeln von 10 mL Zellkulturmedium von fast 100 % konfluierende 75 cm2 Kolben S2-Zellen (oder, alternativ, 20 mL von einem 150-cm-2 -Kolben) durch pipettieren. Übertragen Sie das Steuerelement S2 Zellkulturmedium auf eine frische 15 mL oder 50 mL konische Rohr. Folgenden Schritte 3,4-3,7 klar lysate von Zellen und zelltrümmer durch Zentrifugation (bei 2.500 X g bei 4 ° C für 30 min zu einem Zeitpunkt) und dann übertragen die geräumte Zelle lysate, Konzentratoren und zentrifugiert, um das Steuermedium in Chargen zu konzentrieren 1/10 des ursprünglichen Volumens.Hinweis: Anwendung der S2-konditionierte Medien führt nicht zu erheblichen Zelle Kontraktilität in der Probe. Speichern Sie die konzentrierte S2 Steuermedien bei 4 ° C für mehrere Monate.Hinweis: Nach der Lagerung müssen Sie für die Kontamination zu überwachen. 4. Vorbereitung der Concanavalin A-beschichteten Glasboden-Gerichte und die Beschichtung der S2R + Zellen Machen Sie 10 mL Concanavalin (Con A) Lösung durch Auflösen von Con A 5 mg in 10 mL Wasser für eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL. Aliquoten diese Lösung in bequemer Bände (500 µL bis 1 mL) und speichern Sie es bei-20 ° C. Zubereiten Sie 35 mm Glasboden-Gerichte zu, durch die Beschichtung der Glasanteil jedes Gericht mit 200 µL der Con A-Lösung und inkubieren Sie die Gerichte für ca. 2 min bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur-Haube. Als Nächstes entfernen Sie alle Con eine Lösung (die beibehalten und für zukünftige Experimente wiederverwendet werden kann) und das Geschirr vollständig an der Luft trocknen lassen.NOTES: Gerichte in großen Mengen zubereitet werden und können bis zu 6 Monaten an einem trockenen Ort wie ein Labor Bank Schublade gelagert werden. Jedes Gericht Glasboden ca. 2 mL frische Zellkulturmedien hinzufügen. Aufschwemmen der S2R + Zellen pipettieren der Zellkulturmedium rauf und runter, benutzen, um alle Lose anhaftenden Zellen zu trennen von der Assay getestet werden. Übertragen Sie die resuspendierte S2R + Zellen auf die 35 mm Glasboden-Gerichte mit frischen Zellkulturmedium sind zwischen 50-70 % Zusammenfluss. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop Gewebekultur durch die Konzentration auf und ab durch mehrere Ebenen von den Zellen ausgesetzt Mittel-und eine Schätzung der Anzahl der Zellen zu erhalten.Hinweis: Durch Versuch und Irrtum, kann die entsprechende Dichte der Zellen benötigt, um 50 % – 70 % Konfluenz zu erreichen erreicht werden. Lassen Sie die Zellen an der Con-A-beschichtete Glasboden-Gerichte für 45-60 min.Hinweis: Vollständig angehängte S2R + Zellen erscheinen “gebraten-Ei-Like,” Abgeflachte und Phase-dunkel. 5. Wirksamkeit Test des Mediums Nebel konditioniert und der zellulären Kontraktilität Assay Falls gewünscht, zu bestätigen, die Ausbeute an Nebel-Myc hergestellt und konzentriert aus der S2:Fog-Myc Stall Zellen Linien durch SDS-PAGE und westliche Beflecken. 10 µL konzentriert Nebel-Myc und kochen es für 5 min. folgen Sie den standard-SDS-PAGE und westlichen befleckenden Protokolle und Beflecken für Anti-Myc Nebel-Myc Produktion bestätigen fügen Sie 10 µL Probenpuffer SDS-haltigen hinzu. Entfernen Sie den Schild und Sang M3 Medium aus den beigefügten S2R + Zellen aus Schritt 4.3 durch sanft pipettieren und fügen Sie sorgfältig Rücken 75 µL frische Schild und Sang Medium beschränkt die Menge an Nebel konditioniertes Medium verwendet hinzu. Der Glasanteil der Glasboden Schale fügen Sie 75 µL Nebel bedingt Medien aus Schritt 5.2 bringen das Gesamtvolumen auf 150 µL, bei einem 1:1 Verhältnis von Nebel konditioniert, Schild und Sang M3 Medien hinzu.Hinweis: Ein Gesamtvolumen von 150-200 µL ist musste der Glasanteil ein typisches Gericht der Glasboden vollständig abdecken; Allerdings hängt dies die Dimensionen der Glasboden Schale verwendet. Überwachen Sie die Kontraktilität der Zellen durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit 20 X oder 40 X Vergrößerung, um ein ganzes Feld von Zellen zu beobachten. Die Morphologie der Zellen zu verfolgen und das abwechselnde Muster aus dunklen Phase und Phase Licht kräuseln bezeichnend für die Formänderung suchen.Hinweis: Die Anwendung der Nebel führt in der Regel um 30 % – 50 % der S2R + Zellen in der zellulären Verengung, und nach 10 Minuten beginnen die Zellen zu entspannen, wieder in ihrer glatten Kanten, gebraten-Ei-wie Morphologie. Die Robustheit der zellulären Kontraktilität zu überwachen. Wenn die Zelle Antwort sehr stark mit einem 1:1 Verhältnis von Nebel konditioniertes Medium, frische Schild und Sang Medium ist, reduzieren Sie die Menge der Nebel konditioniertes Medium, das konzentrierte Nebel-Myc-Medium für zukünftige Experimente zu konservieren. Verwenden Sie unverdünnt Nebel konditioniertes Medium, wenn ein Verhältnis von 1:1 nicht zu robust zellulären Verengung führt; in der Regel produziert ein Verhältnis von 1:3 genug Antwort auf das Experiment erfolgreich durchführen.Hinweis: Sobald das angemessene Verhältnis von Nebel bedingt Mittel-und frische Schild und Sang Medium pro angesichts Charge von Nebel konditioniertes Medium besteht, verwenden Sie dieses Verhältnis für alle anderen Experimente. Überwachen Sie-Muskel Myosin II Dynamik während der zellulären Kontraktilität Test stabilere S2R + Zelllinie, die GFP-Tags regulatorische leichte Kette (S2R +: Sqh-EGFP) ausdrückt. Mit den etablierten Verhältnis von Nebel konditioniertes Medium, frische Schild und Sang M3 Medium aus Schritte 5,2-5,5, Zelle-kultivierte Medium mit einer Pipette und fügen wieder frisches Schild und Sang Medium im Bereich Glas der Schale verglast-Talsohle. Perfundieren Sie Nebel konditioniertes Medium im vorgegebenen Verhältnis beim Erwerb einer Bildsequenz von lebenden Zellen; Achten Sie darauf, nicht die Glasboden-Schüssel während der Perfusion bewegen. 6. Fixierung und Färbung der verengten S2R + Zellen S2R + Zellen mit einer 10 % Paraformaldehyd Lösung in PEM Puffer (100-mM-Rohre, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9) zu beheben.Hinweis: PEM Puffer erfolgt in der Regel auf 2 x Stammlösung und kann Monate bei 4 ° c gelagert Entfernen Sie das Zellkulturmedium vom Nebel behandelt S2R + Zellen durch pipettieren und sofort mit 1,5-2,0 mL 10 % Paraformaldehyd-Lösung zu ersetzen. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.Hinweis: Feste Zellen können in Fixierung Lösung bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden; Es ist jedoch wichtig, dass die ersten 15 min Fixierung bei Raumtemperatur erfolgt vor der Übertragung von Zellen auf 4 ° C. Entfernen Sie die 10 % Paraformaldehyd Lösung durch pipettieren und dieses organischen Abfall-Produkt entsorgen Sie ordnungsgemäß. Spülen Sie die Zellen durch sanft pipettieren 1,5-2,0 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die 35-mm-Glasboden Schale. Entfernen Sie die alte PBS durch pipettieren und ersetzen Sie es mit 1,5-2,0 mL frische PBS 2 x mehr passives Fixierung Lösung zu entfernen.Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen nicht ab diesem Zeitpunkt auf dem Protokoll austrocknen. Blockieren Sie die Zellen mit ca. 200 µL 5 % normalem ziegenserum verdünnt mit PBS-Puffer, die mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel (PBST) für 20 min bei Raumtemperatur ergänzt wurde.Hinweis: In der Regel enthalten blockierende Lösungen Serum Organismus dem entspricht, was, dem der Sekundärantikörper in ausgelöst werden. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung in PBST verdünnen. Verwenden Sie ein Volumen von etwa 200 µL der Glasanteil der Glasboden Schale vollständig bedecken. Entfernen Sie die blockierende Lösung durch pipettieren und fügen Sie die primären Antikörper-Lösung der Glasanteil der Schale direkt hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren oder alternativ über Nacht bei 4 ° c inkubieren Wenn über Nacht bei 4 ° C Bebrüten, wickeln Sie die 35-mm-Glasboden Schale mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern. Entfernen Sie die primären Antikörper-Lösung durch pipettieren und spülen Sie die Zellen durch pipettieren 1,5-2,0 mL frische PBS in die 35-mm-Glasboden Schale. Entfernen Sie PBS durch pipettieren zu und ersetzen Sie es mit 1,5-2,0 mL frische PBS 2 x mehr. Bereiten Sie eine Lösung der Sekundärantikörper in PBST verdünnen. Ein Volumen von 200 µL ist ausreichend, nur der Glasanteil des Gerichtes zu decken. Die sekundäre Antikörper-Lösung direkt hinzufügen der Glasanteil des Tellers. Die Zellen mit Sekundärantikörper Lösung für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie die 35-mm-Schale mit Parafilm, wenn Inkubation über Nacht, um Verdunstung zu verhindern. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper-Lösung durch pipettieren und spülen Sie die Zellen mit PBS durch pipettieren 1,5-2,0 mL frische PBS auf den Teller. Die alten PBS zu entfernen und ersetzen Sie es 2 x mehr, das gleiche Verfahren. Bewahren Sie die feste und gefärbten Zellen indem man genug von einer Anti-Fade fluoreszierende Eindeckmittel zur Deckung der Glasanteil der Glasboden-35-mm-Schale. Die Proben bei 4 ° C und lichtgeschützt aufbewahren.Hinweis: Das Fluoreszenzsignal wird langsam über Monate vergehen, auch bei sachgemäßer Lagerung. Für beste Ergebnisse, Bild innerhalb einer Woche. (7) Bildgebung und Quantifizierung des zellulären Kontraktilität Assays Bild fixiert S2R + Zellen mit einem Standard-invertiert Lichtmikroskop mit Phasenkontrast, DIC oder Fluoreszenz-imaging-Funktionen. Erfassen Sie mit 20 X oder 40 X Vergrößerung, 10-30 dortiger Bildfelder der Zellen abhängig von der Zelldichte, mit dem Ziel des Erwerbs der Bilder von 200 oder mehr Zellen pro Zustand. Mit einer Standardzelle Zähler, zählen Sie und notieren Sie die Anzahl der vertraglich vereinbarten (Phase-dunkel, geschwenkten) und außertariflichen Zellen pro jedes Feld erfasst.Hinweis: Es empfiehlt sich, zwei Forscher unabhängig zählt der kontrahierten und außertariflichen Zellen pro Feld nehmen, oder alternativ der gleichen Forscher kann zählen die gleichen Bildfeld von Zellen dreimal, ermöglicht eine durchschnittliche Anzahl von beauftragt und außertariflichen Zellen pro Feld berechnet werden. Bereiten Sie mehrere Con-A-beschichtete Glasboden Gerichte pro versuchsbedingung, wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Pipette auf und ab der Zellkulturmedium lose anhaftenden S2R +: Sqh-EGFP-Zellen zu vertreiben und sie Platte, so dass sie 50 % – 70 % Zusammenfluss in der 35-mm-Glasboden-Gerichte sind. Lassen Sie die Zellen, die für 30-45 Minuten zu befestigen. S2R +: Sqh-EGFP Bildzellen live über einen Spinning-Disk, fegte Feld confocal Mikroskop oder durch Licht-Blatt Mikroskopie über 60 X – 100 X Vergrößerung. Entfernen Sie den Schild und Sang M3 Medium aus der Glasboden-Schale mit angehängten S2R +: Sqh-EGFP-Zellen. Durchspülen der vorgegebenen Verhältnis von Nebel-Myc konditionierten Medium, frische Schild und Sang M3 Medium von Schritte 5.2-5.5 direkt auf der Glasanteil der Glasboden-Schale mit einer Pipette vorsichtig, um nicht zu stören die Position des Gerichts auf das Ziel. Bilder für 12-15 min zu erwerben, um die Initiierung und vollständige Kontraktion der S2R +: Sqh-EGFP Zellen zu erfassen.Hinweis: Wenn für nicht-Muskel Myosin oder Myosin-Missbrauchsfälle Färbung, ist die Bildung eines engen Myosin-Ring an der Oberfläche der Zellen auch bezeichnend für Kontraktilität. Wenn imaging S2R +: Sqh-EGFP Zellen Leben, RLC EGFP-Tags bilden ähnliche fest (siehe Abbildung 3) indikativ der Kontraktilität klingelt. Formänderung, die auftritt, werden die Zellen, die “Mütze”, verursachen 3D-Form aufnehmen; die Fokusebene des Mikroskops müssen möglicherweise angepasst werden, um diese Zelle Formänderung zu verfolgen. Unter RNAi-Bedingungen zu steuern, in der Regel 30-50 % der Zellen durchlaufen Verengung auf die Zugabe von Nebel. Beachten Sie, dass einige RNAi-Bedingungen zu Verengung in der Abwesenheit der Nebel führen können.

Representative Results

S2 und S2:Fog-Myc Zellen konfluierende Bedingungen in einem 150-cm2 Gewebekultur Kolben in der Nähe von gewachsen waren und mit 25-75 µM CuSO4 behandelt wurden, über einen Zeitraum von 24-48 Stunden induzieren die Expression von Nebel-Myc (Abbildung 2). Proben aus S2-Zellen (Abb. 2A) und S2:Fog-Myc Zellen (Abbildung 2B) wurden entfernt und Nebel-Myc Produktion von western-Blot überwacht wurde. Wie erwartet, konnten wir erkennen, Nebel-Myc in Medien aus S2-Zellen unter allen Bedingungen geerntet. Jedoch wir Nebel erkennen, in den Medien von der S2:Fog geerntet-Myc stabile Zelllinie bereits 24 Stunden nach der Induktion mit 75 µM CuSO4. S2R + Zellen zu Con-A-beschichtete Glasboden-Gerichten eine EGFP-Tags regulatorische leichte Kette (GFP-RLC) von nicht-Muskel Myosin II (Abbildungen 3A und 3 b) zum Ausdruck zu bringen. Live Cell Imaging erfolgte auf einem inversen Mikroskop, ausgestattet mit einem 100 X / 1.4 NA Objektiv während der Perfusion der Nebel bedingt Medien. Ca. 5 Minuten nach der Behandlung mit Nebel-Myc, gebildet die RLC Ringe bezeichnend für nicht-Muskel Myosin II Verengung. Diese Ringe können durch Immunostaining S2R +-Zellen mit einem Antikörper gegen eine synthetische Phosphopeptide entsprechende, Rückstände, die rund um die Ser19 der menschlichen Myosin RLC (Abbildungen 4A und 4 b) beobachtet werden. Dieser Antikörper cross-reacts mit Drosophila RLC. Hier haben wir ein repräsentatives Beispiel für die zelluläre Kontraktilität Assay nach einer 7-Tage-Behandlung der Zellen mit Kontrolle RNAi und DsRNA gegen Rho1 (Figuren 5A – 5E). S2R +-Zellen wurden auf dem Con-A-beschichtete Glasboden-Geschirr verchromt und mit Nebel bedingt behandelt (+ Nebel) Medien oder Kontrolle (-Nebel). Die Anzahl der vertraglich vereinbarten Zellen wurden dann nach Fixierung quantifiziert. Der Phase-dichten Rüschen indikativ Verengung war erschöpft Kontrollzellen mit Nebel-konditionierte Medien (Abb. 5B) behandelt. In Abbildung 5Csind Rho-abgereicherte Zellen mit S2 konditioniertes Medium behandelt ein typisches Beispiel für glatten Kanten, gebraten-Ei-wie Morphologie. Beachten Sie, dass Rho eine Rolle in der Nebel-Signalweg sowie in zytokinese spielt; so, Rho-abgereicherte Zellen oft nicht richtig teilen, führt zu einer Zunahme der Zellgröße und Diploidie. Behandlung des Steuerelements erschöpfte Zellen mit Nebel-konditionierte Medien typische führt bis 30 % – 50 % der Zellen in der Verengung, während wir es versäumt, die erhebliche Einengung in Rho erschöpft Zellen zu beobachten. Abbildung 1:der vermeintlichen Nebel Signalweg. In Ermangelung von Nebel, der Gα-12/13 -Untereinheit, Konzertina (Cta), zusammen mit seinen Bindungspartner, Gϒ und Gβ, inaktiv sind und im Zusammenhang mit der Co-Rezeptoren Nebel und Smog. Ric-8 Begleitpersonen Cta und regelt seine subzelluläre Lokalisation. Bei Nebel verbindlich, Cta distanziert von Gϒ und Gβ Rekruten RhoGEF2 an der Zellmembran, wo es den Austausch des BIP für GTP in die kleine GTPase Rho1 katalysiert. GTP-gebundenen Rho1, jetzt aktiv aktiviert Rho-Kinase (Rok), die die RLC von nicht-Muskel Myosin führt zu seiner Aktivierung und anschließende zelluläre Kontraktilität phosphorylates. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Zeitlicher Verlauf der Nebel-Myc Produktion. Diese Tafeln zeigen Zellkulturmedium geerntet von einem in der Nähe von 100 % konfluierende Kolben (A) Kontrollzellen S2 oder (B) S2:Fog-Myc stabile Zellen. Die Zellen wurden über einen Zeitraum von 24-48 Stunden mit 25-75 µM CuSO4 behandelt. Das Zellkulturmedium wurde gesammelt und vorbereitet für SDS-PAGE und westliche Beflecken. Nebel-Myc wurde durch einen Anti-Myc-Antikörper festgestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Live Cell Imaging Nebel-induzierte Verengung. Stabile S2R + Zelllinien EGFP getaggt RLC von nicht-Muskel Myosin II wurden durch fegte Bereich konfokalen Mikroskopie abgebildet, während die Perfusion der Nebel bedingt Medien zum Ausdruck zu bringen. Zeit wird in Minuten und Sekunden angezeigt. (A) dieses Panel zeigt ein Bild von einem Brennebene in der Nähe der Zelle-Deckglas Schnittstelle zum Zeitpunkt 0:00 Uhr bevor die Perfusion der Nebel-Myc. (B) dieses Panel eine Zeitreihe zeigt (0:30-10:00) von Aufnahmen mit einer Brennebene am oberen Rand der Zelle. Die weißen Pfeile zeigen die Reorganisation der nicht-Muskel Myosin II von EGFP-RLC in kontraktilen Ringe während Verengung angegeben. Der Maßstab ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Phosphoryliert RLC lokalisiert an kontraktilen Ringen nach Induktion der Verengung durch Nebel-Myc. S2R +-Zellen wurden behoben und gebeizt für Actin mit Phalloidin (rot), phosphorylierten RLC mit einem Phosphoserine-19-Antikörper (grün) und DAPI (DNA, blau), nach der Behandlung mit (A) oder (B) Nebel Myc-konditioniertes Medien. Beachten Sie die Reorganisation der phosphorylierten RLC in Ringe auf den Zusatz von Nebel-Myc. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Repräsentative Quantifizierung des Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität Assays. S2R +-Zellen wurden mit (A und B) Kontrolle RNAi oder (C und D) DsRNA gegen die kleine GTPase Rho1 für 7 Tage behandelt. Nach dieser Zeit die Zellen wurden auf dem Con-A-beschichtete Glasboden-Geschirr verchromt und mit (A und C) Kontrolle oder (B und D) Nebel Myc-konditioniertes Medien behandelt wurden. Die Skala bar stellt 10 µm. (E) A Streudiagramm zeigt Mittelwert und 95 % Konfidenzintervall für den Bruchteil des vertraglich vereinbarten Zellen pro Zustand. Einzelne Punkte stehen für den Bruchteil des vertraglich vereinbarten Zellen pro Gesichtsfeld bei 40 X Vergrößerung (10-120 Zellen pro Feld) und die Zahlen in Klammern geben, dass die Gesamtzahl der Zellen für die vertraglich vereinbarten und nicht vertraglich Zellen über drei Separate gezählt RNAi-Experimente. Sternchen bezeichnen einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen RNAi-Nebel-behandelt und Bedingungen, die durch einfache ANOVA (p < 0,0001) mit Tukey mehrere Vergleich post Hoc Analyse. Beachten Sie, dass gab es keinen statistisch signifikanter Unterschied (n.s.) zwischen Rho1 RNAi-behandelten Proben mit Steuerung oder mit Nebel-Myc-konditionierte Medien behandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für einen zellbasierte Kontraktilität-Assay mit einer Drosophila Gewebekultur Zelllinie (S2R +-Zellen), die nicht-Muskel Myosin II Verengung als Reaktion auf Nebel erfährt Signalisierung. Dieser Test eignet sich für die Untersuchung der Nebel Weg, als auch die Mechanismen, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität regulieren.

Zelle-Kultivierung Überlegungen:
Die Bedingungen, unter denen S2R + Zellen erhalten bleiben, ist entscheidend für verlässliche Daten aus diesem Test zu erreichen. Wenn Sie planen, führen Sie die Kontraktilität-Assay, es am besten, S2R +-Zellen in Schild und Sang M3 Insekt Medium beizubehalten. Während in anderen Insekten Zellkulturmedien S2R + Zellen gedeihen können (z.B.SF900 oder Schneiders Insekt Medium), verlieren sie oft ihre Reaktionsfähigkeit, Nebel. S2R + Zellen, die eine hohe Passagenanzahl, in der Regel mehr als 20-25 Passagen, anfangen, Empfindlichkeit, RNAi verlieren. Es empfiehlt sich, frühe Passage Zellen für alle Experimente verwenden. Ein weiterer wichtiger Aspekt für RNAi Erschöpfung Experimente ist die Auswahl geeigneter Kontrollen. Gemeinsamen Negativkontrollen gehören DsRNA targeting EGFP oder pBlueScript, weder die Homologie zu fliegen Genom haben. Ausrichtung auf Proteine in dem Nebel Weg (Rho, Rok, etc.), die, wenn aufgebraucht, zu verhindern, dass die Aktivierung der nicht-Muskel Myosin Kontraktilität, sind auch nützliche Steuerelemente. S2:Fog-Myc Zellen können in eine alternative Zellkulturmedium wie SF900 mit 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt und 0,25 Amphotericin B. Beachten Sie, dass FBS ist nicht erforderlich, wenn Zellen in SF900 zu züchten. Zelldichte ist auch eine wichtige Komponente, um alle Aspekte der Drosophila Gewebekultur Zellen. Im Gegensatz zu Säugetieren Gewebekultur Zellen, Drosophila-abgeleitete Gewebekultur Zellen gedeihen am besten unter höhere Zelldichten (dichten nicht niedriger als 5 x 105 Zellen/mL). Es ist jedoch bei der Durchführung dieser Assay entscheidend, dass die Zellen nicht auf Con-A-beschichtete Glasboden Gerichte über 80 % Zusammenfluss, vernickelt sind wie die Quantifizierung der vertraglich vereinbarten versus nicht-Vertrag Zellen extrem langweilig wird.

Kritische Aspekte und Alternative Ansätze des zellulären Kontraktilität Tests:
Die Produktion von Nebel, die Liganden, die nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität auslöst ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Assay. Das Nebel -Gen kodiert ein Protein von 730 Aminosäuren mit einem prognostizierten Molekulargewicht ~ 78 kDa26. Heilkräfte Analyse ergab eine Strecke von 12 hydrophoben Überreste im Nebel der amino-Terminus, die als eine Sekretion Signalsequenz funktionieren könnte. Darüber hinaus enthält die kodierende Sequenz auch mehrere Standorte für mögliche N und O verbunden Glykosylierung, weitere hindeutet Nebel ein sekretierten Proteine26ist. Zur Unterstützung wurde Nebel zu sekretorischen Vesikel in mutmaßlichen Epidermiszellen in der apikalen Verengung16lokalisiert. Nebel-Myc Ausdruck wurde nach Zugabe von Kupfersulfat auf das Medium induziert und Antikörper gegen Nebel oder Myc erkannt, ein 150-kD-Protein aus Kulturmedium geerntet von induzierten Kulturen aber nicht von induzierten Medien aus S2-Zellen fehlt die Nebel-Myc-Konstrukt. Das Molekulargewicht war höher als die prognostizierten 80-kD Molekulargewicht von Nebel und deutet darauf hin, dass die sekretorische Maschinerie der S2-Zellen Glycosylate das Protein vor Exozytose kann. Aufgrund der möglichen Variabilität im Nebel Reinigung empfiehlt es sich, die gleiche Charge von Nebel bedingt Medien für alle Experimente verwenden. Aus denen große Chargen von konzentrierter Nebel-Myc Medien helfen dabei, die Konsistenz in Runden von Experimenten.

Der Erfolg dieser Assay hängt auch davon ab, selbstbewusst Identifizierung von Zellen, die Einschnürung unterzogen wurden. Während verengte Zellen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, beobachtet werden können, durch Färbung für Aktin und Myosin-Muskel II, ist der zuverlässigste Weg zu identifizieren und quantifizieren verengte Zellen durch Phasenkontrast- oder DIC Mikroskopie. Genaue Anzahl lässt sich mit 20 X – 40 X Vergrößerung auf die gängigen Lichtmikroskopen. Obwohl das Protokoll geschrieben hier Glasboden-Gerichte verwendet wird, kann der Test auch durchgeführt werden mit standard 1,5 Glasdeckgläser beschichtet mit Con A. Die Zugabe von Nebel kann in 35 mm der Gewebekultur auf einem deckgläschen legte auf Parafilm, um die Begrenzung der Nebel verwendet für jedes Assay erfolgen. Die Qualität der Fixierung ist eine wichtige Komponente des Assays, da schlecht feste Zellen zu Fehlalarmen führen können. Mit frischen Fixierung Lösung und sicherstellen, dass werden nie trocken Zellen einmal festgesetzt zu zuverlässigere Ergebnisse führen. Zu guter Letzt ist es wichtig, eine große Anzahl von Zellen zu zählen. In der Regel nur 30 % – 50 % der unbehandelten oder Kontrolle RNAi-behandelten Zellen verengen im Anschluss an die Perfusion der Nebel. Allerdings gibt es eine basale Ebene der Verengung, die in S2R + Zellen, auftritt, so dass eine große Anzahl von Zellen benötigt wird, um sicherzustellen, dass jede Änderung in der Fraktion der verengten Zellen durch Behandlungen. Darüber hinaus kann die Erschöpfung von einigen Proteinen beteiligt an der Regulation des nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität zu hyper-Kontraktilität, auch in Abwesenheit von Nebel führen. Die hier vorgestellten Daten ist von mehr als 3.600 Zellen, die in drei aufeinander folgenden RNAi-Behandlungen mit der gleichen Charge von Nebel bedingt Medien gezählt wurden.

Anwendungen des zellulären Kontraktilität Tests:
Dieser Assay Kontraktilität, gekoppelt mit RNAi screening-Verfahren, bietet ein leistungsfähiges System zur Untersuchung von Zelle signalisieren, Morphogenese und zelluläre Kontraktilität. Zuvor hat zur, einer der zwei Nebel Co-Rezeptoren21verwendet. Ein gezielte Bildschirm von 138 G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) durch RNAi in S2R + Zellen leer ist, und seine Fähigkeit zur Reaktion auf Nebel wurde untersucht, wie in dem hier vorgestellten Protokoll beschrieben. Von den 138 GPCRs, ein einziges, wurde zuvor fußgelenkes gen, jetzt bekannt als Nebel, aufgedeckt. Weitere Untersuchung über die Funktion der Nebel zeigte, dass nicht nur es für Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität in S2R +-Zellen bedurfte, aber es auch wichtig für Gastrulation war bei der Entwicklung von Drosophila21. Darüber hinaus wurde dieser Assay verwendet, um nachzuweisen, dass Ric-8, ein nicht-kanonischen GEF ist auch ein Bestandteil im Nebel Weg27-Signalisierung. Eine Reihe von Epistasis RNAi Experimenten gepaart mit der Kontraktilität Test gezeigt, dass Ric-8 mit der Gα-12/13 -Untereinheit Cta und Funktionen interagiert, die es innerhalb der Zelle zu lokalisieren ist entscheidend für die Nebel-induzierte zellulären Kontraktilität31 .

Drosophila Gewebekultur eignet sich gut für Anfänger, wie die Zellen sind bei Raumtemperatur leicht zu pflegen, keine CO2 benötigen oder Zellkulturmedium gepuffert und sind robust, solange die richtige Zelldichten Kultur gepflegt werden. Die zelluläre Kontraktilität-Assay wurde erfolgreich von der Labor-Sektion eines Bachelor Zelle Biologie Kurs durchgeführt wo die Studenten wenig bis gar keine Erfahrung mit der Kultivierung von Zellen oder Mikroskopie hatten. Der zellulären Kontraktilität Test hier vorgestellten stellt ein leistungsstarkes, Zell-basierte Tool, das in Gen Entdeckung eingesetzt werden kann, oder um den Nebel Signalweg zu verhören, hilft uns besser zu verstehen, Entwicklungsprozesse wie apikalen Verengung und nicht-Muskel Myosin II Kontraktilität, im Allgemeinen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Mitglieder des Rogers Labors und Applewhite Labor, Greta Glover, und die Studenten in die Reed College Frühjahr 2018 Zellbiologie natürlich, die zur Entwicklung dieses Protokolls beigetragen haben bedanken. Darüber hinaus möchte die Autoren Mitglieder des Ritz Lab for sorgfältig lesen und bearbeiten diese Handschrift zu danken. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Science Foundation unter prämiennummer 716964 D.A.A. und A.R und der Reed College Biologie-Abteilung unterstützt.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
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References

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
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