非筋ミオシン II 収縮を介して折り返されている陥シグナル伝達経路ショウジョウバエS2R + 細胞を調査する細胞ベースのアッセイ

1.ショウジョウバエ培養細胞のメンテナンス S2R +、S2R +: RLC の EGFP と S2:Fog を維持-Myc セル室温 20 ° C そして 25 ° C, 10% 牛胎児血清、ペニシリンの 100 単位/ml、100 μ g/mL ストレプトマイシンで 0.25 アムホテリシン B とシールドと歌った M3 昆虫培の間が望ましい、密度 5 x 105セル/mL よりも低くします。注: セル密度が低い死に至る。 すぐに細胞の低温保存バイアルを解凍し、培養フラスコに転送します。文化が確立され、解凍により細胞死の兆候が沈静化しているまで、細胞培養液中の 4-5 mL の容積の小さな組織培養のフラスコ (12.5 cm2または 25 cm2) で開始します。注: 融解による細胞死の兆候には、滑らかで、丸みを帯びた形状と壊死細胞の組織培養の培地直説法で細胞の残骸の小さい暗いビットを欠いている非付着性のセルが含まれます。 ゆっくりとにより、100% の confluency、細胞間スペースがほとんどない、彼らは互いに積み上げを開始する (4-8 d) 数日間妨げられていない成長する細胞組織培養のサイズをスケール アップ。細胞培養培地 10 mL を添加した (75 cm2) の大きい組織培養フラスコにこの 100% コンフルエント小さい 12.5 cm2または 25 cm2フラスコからすべてのセルを転送します。注: 75 cm2のフラスコの中の細胞を維持する十分な細胞ほとんどの実験になります。 上下、組織培養プラスチックから、緩く付着細胞を取り除くためにそれを使用して細胞培養液をピペットでセルごとの 3-4 d の通路します。今新鮮なフラスコに再懸濁細胞を含むこの媒体を転送します。各通路の新鮮な細胞培養培地で細胞 1:4 を希釈し、必要に応じて繰り返します。 2 ショウジョウバエS2R + 細胞の RNAi 治療 注: ロジャース、ロジャースを参照して6昆虫事情に適した dsRNA を生成する方法の詳細について。 S2R + 細胞を密度 105セル/mL、完全なシールドと歌った M3 を使用して x 5 細胞培養媒体 RNAi 治療よりも生存率も低くを助長または 6-12 ウェルの組織培養プレートに転送します。 ティッシュ文化フードで働いて、優しく 6 ウェルまたは 12 ウェルの組織培養プレートの傾斜やピペットで細胞培養の培地を吸引によって古い細胞培養培地を削除します。すぐに各ウェルにピペッティングによる新鮮な細胞培養液の 1 mL でこの古い細胞培養液を置き換えます。注: この行うことができます実質的な損失することがなく細胞を細胞培養液を交換する前に 30-45 分緩く付着する許可されている後。 ロジャース、ロジャースの詳細なプロトコルに従う生成された dsRNA の 10 μ G/ml を追加6 RNAi 条件ごとのセルの各ウェルの組織培養の培地に直接ピペッティングによる。 毎日、新鮮な培地 1 mL と RNAi 条件ごとの dsRNA の 10 μ G/ml で細胞培養液を交換するこの手順を繰り返します。注: RNAi 実験は通常実施 7 d;しかし、正確なタイミングは蛋白質の転換および dsRNA の有効性に依存しています。他のターゲットは、長く治療6を必要としながら、RNAi 治療 3 d と短くは効果的にある特定の蛋白質の細胞を使い果たします。 3. 霧の生産と収穫 スケール アップ、S2:Fog の成長-マキシへほぼ 100% 合流 75 cm2のフラスコ細胞培養培地 (あるいは細胞培養培地 20 mL で 150 cm2フラスコ) の 10 mL のセルを取得する 4-8 d の妨げられていない成長させることで Myc セルマイズ霧生産。 100 mM CuSO4 (または 100 mm CuSO4 150 cm2フラスコ 100 μ L) の metallothionine プロモーターの誘導のためにほぼ 100% コンフルエント 75 cm2のフラスコに 50 μ L を追加します。48 時間室温で孵化させなさい。 ピペッティングによる組織培養用フラスコから霧 Myc 含有培地を削除し、15 mL や 50 mL の円錐管にそれを転送します。細胞および細胞残骸の中をオフに 10-15 分のための 4 ° C で 2,500 × gで遠心分離機します。 新しい円錐管にクリアされたセル培地を転送し、氷の上にそれを維持します。作業のバッチ, 再生セルロース膜で 3,000 MW コンセントレーターの 15 mL にクリアされた培地 5 mL を転送し、媒体を集中する時 4 ° C、30 分で 2,500 × gで遠心分離機のそれ。注: また、大容量ボリュームをコンセントレーター可能性があります使用される (50 mL)。濃度、中に霧を豊かに、暗い色培地は V 形フィルターの下部を構築する開始されます。 コンセントレーターの”V”の下にピペット チップを挿入し、遠心分離の各ラウンド間暗い着色されたメディアを削除、新鮮な 1.7 mL および microfuge の管にそれを転送します。氷の上のメディアを維持します。 手順 3.4 と 3.5 暗い色を削除することによって集中霧 Myc メディアとより多くの交換を繰り返して同じコンセントレーターを使用して職員への贈り物媒体、媒体が 1 に集中してになるまで、元のボリューム (つまり、10 mL から 1 mL の 10 分開始材料)。 4 ° C で集中霧 Myc を格納します。注: 後、必ずストレージの拡張の期間に起因する可能性があります細菌の汚染を監視するため。 Lysate を形成する変性 SDS 含んでいるバッファーの 10 μ L を高濃度霧 Myc 培地の 10 μ L を混合することにより SDS ページを実行します。35 で SDS ページのゲルを実行 mA 約 1 h. ゲル硝酸セルロースの膜 (または転送または、PVDF 膜) 120 で 1 時間の mA。150 kDa のバンドを検出する市販 Myc 抗体を用いたウエスタンブロットを実行します。注: バッチごと馴化培地霧 Myc の濃度が異なる場合があります。それは、分析を実行するために霧 Myc の正確な濃度を測定する必要はありませんが、各バッチの有効性は実験を実行する前にテストする必要があります。 次の手順、3.1 3.2 S2 細胞のほぼ 100% コンフルエント 75 cm2のフラスコから細胞培養培地 10 mL (または 150 cm2フラスコからまた、20 mL) までにピペッティングを収集 S2 エアコン メディア コントロールを準備します。新鮮な 15 mL や 50 mL の円錐管に S2 細胞培養培地コントロールを転送します。 手順 3.4 3.7、(2,500 x をg時に 30 分の 4 ° C) での遠心分離によって細胞および細胞残骸のライセートをオフにクリア細胞ライセートをコンセントレーターに転送し、遠心分離機のバッチ内で制御媒体を集中させる1/10 元のボリューム。注: S2 調節されたメディアの応用は実質的な細胞収縮アッセイにはつながらない。 数ヶ月間集中の S2 の 4 ° C でメディア コントロールを格納します。注: ストレージ後、必ず汚染を監視します。 4. コンカナバリン A コーティング ガラス底皿の S2R + 細胞のメッキ準備 コンカナバリン a (con A) ソリューションの 10 mL を最終濃度 0.5 mg/mL を水 10 mL に con A 5 mg を溶解してください。分注このソリューションをより便利なボリューム (1 mL を 500 μ L) し、-20 ° C で保存 コン A 溶液 200 μ L を各皿のガラス部分をコーティングすることにより 35 mm ガラス底の料理を準備し、ティッシュ文化フードの室温で約 2 分間料理を孵化させなさい。次に、(これは保持および未来の実験のために再利用できる) すべての con A ソリューションを削除し、完全に風乾する料理。ノート: 料理大量に準備することができます、研究室のベンチ引き出しなど乾燥した場所で 6 ヶ月保存できます。 ガラス底皿ごとに新鮮な細胞の培養基約 2 mL を追加します。任意の緩く付着細胞をデタッチするのにはそれを使用して上下、細胞培養液を分注してアッセイによってテストする S2R + 細胞を再懸濁します。 合流 50%-70% の間にあるので新鮮な培養液を含んでいる 35 mm ガラス底皿に再懸濁の S2R + 細胞を転送します。培養顕微鏡下で細胞密度を確認するには、セルの数の見積もりを取得する媒体中に浮遊細胞のいくつかの平野を通して上下に焦点を当ててします。注: 試行錯誤 50%-70% の confluency を達成するために必要な細胞の適切な密度を達成することができます。 45-60 分の con A コーティング ガラス底皿に付けるセルを許可します。注: 完全にアタッチされた S2R + セルの表示 ‘揚げ-卵のような’ 平坦化され、段階暗い。 5 霧条件培地および細胞収縮アッセイの有効性テスト 必要な場合、確認霧 Myc の収量を生産し、S2:Fog から集中-Myc 安定細胞 SDS-PAGE および西部にしみが付くことによってライン。10 μ L の濃縮霧 Myc および沸騰 5 分のためにそれは標準的な SDS-PAGE および西部のしみが付くプロトコルに従うし、霧 Myc 生産を確認する反 Myc のしみに SDS 含んでいるサンプルバッファーの 10 μ L を追加します。 軽くピペッティングして手順 4.3 から添付の S2R + 細胞からすべてのシールドと歌った M3 媒体を削除し、慎重に使用霧調節された媒体の量を制限する盾と相培の背面 75 μ L を追加します。 ガラス底皿のガラス部分にステップ 150 μ L、フォグ付きメディアをシールドと歌った M3 の 1:1 の比率で総量をさせる 5.2 からフォグ付きメディアの 75 μ L を追加します。注: 150-200 μ L の総ボリュームは典型的なガラス底皿; のガラス部分を完全にカバーするために必要なただし、使用されるガラス底皿の大きさに応じて変わります。 20 倍または 40 倍の倍率を使用してセルのフィールド全体を観察する位相差顕微鏡による細胞の収縮性を監視します。細胞の形態を追跡し、暗い相と波打ち形状変化を示す段階光の交互になるパターンを探します。注: 霧のアプリケーションは通常、細胞の収縮を経る S2R + セルの 30%-50% に、10 分後セルは、リラックスを開始, 彼らの滑らかなエッジ、揚げ卵のような形態に戻る。 細胞の収縮性の堅牢性を監視します。細胞の応答が非常に強力な盾と相培霧調節された媒体の 1:1 の比率を使用して場合は、未来の実験のための高濃度の霧 Myc 培地を節約するために霧調整培の量を減らします。1:1 の比率は堅牢な細胞収縮; につながらない場合原液のフォグ付きのメディアを使用します。一般的には、1:3 の比率は、実験を成功させるための十分な応答を生成します。注: 霧調節された培地バッチ与えられたあたりフォグ付きシールドと相培中長期の適切な比率が確立されるは、他のすべての実験のためこの比率を使用します。 ラインを使用して安定した S2R + セル GFP 付けられた調節軽鎖 (S2R +: Sqh EGFP) を表現する細胞収縮アッセイ中非筋ミオシン II のダイナミクスを監視します。 確立された霧調整培率新鮮なシールドと歌った M3 媒体を使って手順 5.2 〜 5.5 からピペットで細胞培養培地を取り除きし、ガラス張り底皿のガラス部分に戻って新鮮なシールドとサンウの媒体を追加します。所定の比率で霧調整培を灌流した生きているセルのイメージ シーケンスを取得中灌流時にガラス底皿を移動しないよう注意してください。 6. 固定と収縮 S2R + 細胞の染色 S2R + PEM バッファー (100 mM パイプ、1 mM 1 mM MgCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸 pH 6.9) で 10% パラホルムアルデヒド溶液を使用してセルを修正します。注: PEM バッファー原液 x 2 では、だいたい、4 ° C で数ヶ月保存できます。 ピペッティングによる霧処理 S2R + 細胞から細胞培養培地を削除し、すぐに 10% パラホルムアルデヒド溶液 1.5 2.0 mL に置き換えます。室温で 15 分間インキュベートします。注: 固定セルに格納できる 4 ° C での固定の解決数日間ただし、最初の 15 分固定が 4 ° C にセルを転送する前に室温で行われることが重要です。 ピペッティングで 10% パラホルムアルデヒド ソリューションを削除し、この有機廃棄物を適切に処分します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 35 mm ガラス底皿に 1.5 2.0 mL を軽くピペッティングにより細胞をすすいでください。ピペッティングで古い PBS を削除し、1.5 2.0 mL の新鮮な PBS 2 倍以上残留固定ソリューションを削除するとそれを置き換えます。注: ことセルこの点から上で乾かさないプロトコルが重要です。 0.1% 非イオン性洗剤 (pbst;) 室温で 20 分間で補われた PBS で希釈した 5% ヤギ血清の約 200 μ L で細胞をブロックします。注: 通常、ブロッキング剤は血清で二次抗体が発生生物に一致する含まれています。 PBST でそれを希釈して一次抗体溶液を準備します。ガラス底皿のガラス部分を完全にカバーするのに約 200 μ L のボリュームを使用します。 ピペッティングによるブロッキングのソリューションを削除し、料理のガラス部分に直接一次抗体のソリューションを追加します。室温で 1 時間インキュベートまたは、代わりに、4 ° C で一晩インキュベート 4 ° C で一晩インキュベート、蒸発を防ぐためにパラフィルムで 35 mm ガラス底皿をラップします。 ピペッティング一次抗体・ ソリューションを取り外し、35 mm ガラス底皿に新鮮な PBS の 1.5 2.0 mL のピペットで細胞をすすいでください。ピペッティングで PBS を削除し、1.5 2.0 mL の新鮮な PBS 2 倍以上でそれを置き換えます。 PBST でそれを希釈、二次抗体溶液を準備します。200 μ L のボリュームは十分にちょうど皿のガラス部分をカバーします。 料理のガラス部分に直接二次抗体溶液を追加します。室温で 1 時間二次抗体溶液をセルを孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩 場合は蒸発を防止するために、一晩インキュベート パラフィルムで 35 mm ディッシュをラップします。 ピペッティングによる二次抗体溶液を削除、料理に新鮮な PBS のピペッティング 1.5 2.0 mL の PBS のセルをすすいでください。古い PBS を削除し、置き換えます 2 倍以上、この同じ手順に従います。 35 mm のガラス底皿のガラス部分をカバーする耐フェード蛍光灯取付中の十分を追加することによって固定と染色細胞を保持します。 4 ° c およびライトからのサンプルを格納します。注: 正しく格納されて場合でも蛍光シグナルはヶ月以上崩壊ゆっくり。最高の結果を得るには、一週間以内のイメージします。 7. イメージングと細胞収縮アッセイの定量 S2R + 標準を使用してセルを固定像は逆位相コントラスト、DIC、または蛍光イメージング機能と光学顕微鏡です。20 倍または 40 倍の倍率を使用して、200 の画像を取得することを目標に、細胞密度によって細胞の 10-30 重複しないイメージ フィールドまたは 1 つの条件より多くの細胞をキャプチャします。 標準セルのカウンターを使用して、カウントし、キャプチャ フィールドごと契約 (段階暗い、bonneted 細胞) と noncontracted の数を記録します。注: それは最高のフィールドごとに独立した契約と noncontracted の細胞数を取る 2 人の研究者を持っているかまたは、同じ研究者数えることができる細胞の同じイメージ フィールド 3 回契約の平均数を可能にして計算されるフィールドごと noncontracted 細胞。 4.2 の手順で説明するよう、いくつかの 1 つの実験条件 con A コーティング ガラス底・料理を準備します。上下に緩く付着 S2R +: Sqh EGFP セルをずらすし、35 mm ガラス底皿の 50%-70% の合流しているのでそれらをプレートに培養液のピペットします。30-45 分を付けるセルを許可します。 ライブ画像 S2R +: Sqh EGFP 細胞回転ディスク、掃引フィールド共焦点の顕微鏡を使用してまたは光シート顕微鏡による 60 倍 – 100 倍の倍率。添付の S2R +: Sqh EGFP セルを含むガラス底皿からすべてのシールドと歌った M3 媒体を削除します。 ピペット、目的の皿の位置を邪魔しないように、注意を使用してガラス底皿のガラス部分に直接手順 5.2 5.5 から新鮮なシールドと歌った M3 媒体に霧 Myc 馴化培地の所定の比率を灌流します。開始、S2R +: Sqh EGFP 細胞における収縮をキャプチャするために 12-15 分の画像を取得します。注: 非筋ミオシンのミオシン pRLC 染色する場合、細胞の表面でタイトなミオシン リングの形成は収縮を示すものも。かどうかは収縮の (図 3参照) を示すリング イメージ投射 S2R +: Sqh EGFP セル ライブ、EGFP タグ RLC タイトと同様となります。発生する形状の変化、細胞が「ボンネット」に 3 D 図形を取って顕微鏡の焦点面は、この細胞の形態変化を追跡するために調整する必要があります。下で RNAi 条件のコントロールは、通常、細胞の 30-50% が霧の添加によって収縮を受けます。いくつかの RNAi の条件が不在で霧を圧迫することにつながる可能性があります注意してください。