JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

Published: August 19, 2018
doi:
10.3791/58325
, , , , , , ,
1Department of Biology,The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology,Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences,The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

כאן נתאר וזמינותו contractility באמצעות דרוזופילה S2R + תאי. היישום של ליגנד אקסוגני, gastrulation מקופל (ערפל), מוביל ההפעלה של הערפל איתות contractility מסלול וסלולר. Assay זה יכול לשמש כדי לחקור ברגולציה של חלבונים contractility הסלולר בערפל איתות.

Abstract

פיתחנו מבוססת-תא assay באמצעות תאים דרוזופילה זה recapitulates הפסגה לתעוקה שיזם מקופל gastrulation (ערפל), מורפוגן אפיתל המופרש. במהלך זה assay, ערפל משמש אגוניסט כדי להפעיל את רו דרך מפל איתות הכולל קולטן G-חלבון בשילוב (ערפל), חלבון12 – 13 Gα (מפוחית יד/Cta) ו- PDZ-מחשבים-המכילה גואנין נוקלאוטיד exchange פקטור (RhoGEF2). ערפל איתות תוצאות מהירה ודרמטית לארגונו מחדש של שלד התא אקטין כדי ליצור מחרוזת כויץ את הארנק. ערפל מסיס הוא שנאסף קו יציב תא ומוחלים ectopically S2R + תאים, המוביל שינויים מורפולוגיים כמו הכיווץ הפסגה, תהליך ציין במהלך תהליכים התפתחותיים כגון gastrulation. זה וזמינותו נוטה ההקרנה תפוקה גבוהה, באמצעות RNAi, יכול להקל על הזיהוי של גנים נוספים המעורבים במסלול זה.

Introduction

מחקרים של מופרה שנערך עם מודל גנטי אורגניזמים הוכיחו שלא יסולא בפז להבנתנו כיצד התאים מתלכדות רקמות. מחקרים של דרוזופילה melanogaster, בפרט, הובילו את הזיהוי של גנים מרכזיים ועקרונות ביולוגי אשר יכוונו את מורפוגנזה ופיתוח של אורגניזמים מן ההפריה לבגרות1,2 , 3. במקביל למחקר גנטי שנערך עם דרוזופילה, שורות תאים בתרבית נגזר זבוב הפירות רקמות הופיעו גם כמערכת רב עוצמה כדי לטפל בקשת רחבה של מולקולרית של התא הביולוגי שאלות4, 5 , 6. דרוזופילה תרביות רקמה תאים יש דרישות מינימליות עבור תחזוקה, כפי שהם בתרבית בטמפרטורת החדר, ללא CO2. ככאלה, הן נתונות דימות ברזולוציה גבוהה, ויש להם רמה גבוהה של רגישות גן עיכוב על ידי RNAi6,7. קבוצות רבות השתמשו דרוזופילה תרביות רקמה תאים ככלי לגלות גנים המעורבים, הגדרת צורת התא, cytoskeletal dynamics, הכדאיות, phagocytosis והאות התמרה חושית מסלולים4,8, 9,10,11. כאשר מועסק כמודל לצד כל החיות, שורות בתרבית של תאים דרוזופילה מציעים קבוצת גישות משלימות מאוד להאיץ את הזיהוי של מולקולות חשוב לפיתוח ומספקים מסגרת שבה לקבוע את תפקידי מכניסטית12. כאן, אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא ללמוד את איתות המסלולים המפעילות לתעוקה הפסגה דרך 13,14מסלול (ערפל) מקופל-gastrulation. Assay contractility מבוססת-תא הזה מאפשר לחוקרים לחקור שניהם הערפל איתות לשביל, את המנגנונים המולקולריים המסדירים שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility.

Gastrulation של העובר דרוזופילה מוקדם נחקרה במשך שנים רבות כמודל גנטית את מורפוגנזה אפיתל, הסלולר המעבר אפיתל תא mesenchymal זהות. אחד האירועים מפתח של gastrulation הוא מורפוגנזה של קבוצת משנה של תאים אפיתל לאורך הקו האמצעי הגחון עובריים של טורי כדי כפירמידה צורה15,16,17,18. צורת תא פשוט לשנות תוצאות ההפנמה של התאים mesodermal הרב, שעורר ואת מונעת על ידי פעילות מוטורית של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II הג’נס19,2016,רשת אקטין. עשורים של מחקר גנטי זיהה את ההרכב המולקולרי של מסלול זה, ברצף מיקמה אותם לפי הסדר הבא: 1) ערפל מופרש מהתחום הפסגה של תאי אפיתל בקו האמצע הגחון; 2) ערפל נקשר לקולטנים G-חלבון בשילוב שיתוף, ערפל, ערפיח, ואת אותות באמצעות heterotrimeric G-חלבון כמתחם יחידת משנה של12 – 13 Gα מפוחית יד (Cta), אשר היא ליוותה אותך על-ידי גף קאנונית ריק-8; 3) Cta ומפעילה פקטור המרת נוקלאוטיד גואנין, RhoGEF2, אשר בתורו מפעיל את Rho1 G-חלבון קטן; 4) Rho1 מפעיל קינאז רו (Rok); 5) Rok מפעיל שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility II התחום הפסגה דרך זירחון של שרשרת אור רגולטוריות (RLC), ובכך לייצר לתעוקה הפסגה (איור 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. מוטציות בכמה מרכיבים אלה להפריע את gastrulation נורמלי ותנועות morphogenetic אחרים, כולל היווצרות של דיסק כנף, בלוטות הרוק, המציין כי מסלול זה משמש מספר שלבי דרוזופילה מופרה30,31,32. מסלול ערפל הוא אחד הדגמים הכי למד לעיצוב אפיתל, סיפקה תובנות חשובות איך רקמות ברמת מורפוגנזה מוסדר של שעתוק גנים מונחה שלד התא תא תנועות14,15 ,21.

פיתחנו וזמינותו contractility מבוססת-תא זה recapitulates רבים של הסלולר התגובות במורד הזרם של ערפל נצפו בפיתוח עוברי לטוס17. אנחנו מתוכנן של S2 יציב שורת התאים המבטאת ערפל מתויג ב שלה קרבוקסילי עם myc תחת השליטה של יזם inducible metallothionine ניתן לקצור על התוספת של נחושת גופרתית (CuSO4) למדיום. כאשר ממוזגים ערפל מדיה מוחל ectopically לתאים קולטנים S2 + (S2R +), אשר subline של תאים S2 מאופיינת שלהם ביטוי דיפרנציאלי של קולטנים כגון Frizzled ואינטגרין subunits, התאים עוברים ארגון מחדש של שלד התא מאוד מזכיר את הכיווץ הפסגה12,17,27,33. שינויים אלה יכול להיות שנצפו מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בערפל איזה טיפול מוביל המראה של שלב-כהה קפלים מעידה על עלייה רדיאלי ב contractility II שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן, או על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאן הערפל טיפול מוביל צורה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן טבעות II בתאים המבטאים RLC מתויג EGFP34. טבעות אלו מכילים phosphorylated צולבות הקישור חוטים שרירן רגולטוריות שרשרת אור (pRLC) גלוי ויה immunostaining23,34,35. תגובה זו ערפל-induced נדרש Cta, RhoGEF2, רו ו Rok; לפיכך, שימוש רקומביננטי ערפל-Myc S2R + תאים, הקמנו אמצעי לחקור ערפל-induced כיווץ24,25,של מערכת מבוססת על רקמות-תרבות34.

Protocol

1. אחזקה של תאים תרביות רקמה דרוזופילה לשמור על S2R + S2R +: RLC-EGFP, S2:Fog-Myc תאים בטמפרטורת החדר, רצוי בין 20 ° C ל- 25 ° C, המגן ו- M3 שרו בינוני חרקים בתוספת 10% סרום שור עוברית, 100 יחידות/mL של פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, ל- B 0.25 שהוא גוסס צפיפות לא נמוך מ 5 x 105 תאים/מ ל….הערה: צפיפות התא התחתון להוביל למוות. במהירות להפשיר השמורה הקפאה בקבוקונים של תאים ולהעביר אותם אל בקבוק תרביות רקמה. להתחיל עם בקבוקון קטן תרביות רקמה (12.5 ס מ2 או 25 ס מ2) נפח של 4-5 מ של התא תרבות בינוני עד התרבות היא הוקמה סימנים של מוות של תאים עקב מפשיר היה שכך.הערה: סימנים של מוות תאי עקב מפשיר כוללים תאים שאינם מחסידי חסרי צורה חלקה, מעוגל וסיביות כהה קטן של פסולת הסלולר. תרביות רקמה של תאים עם נמק מצביע בינונית. לאט לאט קנה המידה של הגודל של התרבות רקמות בכך שהוא מאפשר לתאים לגדול ללא הפרעה במשך מספר ימים (4-8 ד) 100% confluency, היכן שאין רווח קטן בין התאים, הם מתחילים להיערם אחד. העברה כל התאים 100% confluent קטנים 12.5 ס מ2 או 25 ס מ2 הבקבוקון זה גדול תרביות רקמה בקבוקון (75 ס מ2) בתוספת 10 מ”ל של מדיום התרבות תאים.הערה: שמירה על התאים בבקבוקון 75 ס מ2 תניב מספיק תאים עבור רוב הניסויים. המעבר את התאים d כל 3-4 על-ידי pipetting המדיום התרבות תאים למעלה ולמטה, משתמש בו כדי לסלק כל באופן רופף דבקה תאים מן הפלסטיק תרביות רקמה. העברת בינוני, עכשיו המכילות את התאים resuspended, לתוך בקבוקון טריים. לדלל את התאים 1:4 תא טריים בינונית תרבות עם כל קטע וחזור כנדרש. 2. RNAi טיפול תאי S2R + דרוזופילה הערה: עיין רוג’רס רוג’רס6 לקבלת הוראות מפורטות על איך לייצר dsRNA מתאים לתרבות חרקים. העברת תאים S2R + צלחת תרביות רקמה. ובכן 6 או 12-ובכן-צפיפות מסיע הכדאיות, נמוך מאשר 5 x 105 תאים למ”ל, באמצעות מגן ושלמה M3 שרו תא תרבות מדיה לטיפולי RNAi. עובד בברדס תרביות רקמה, להסיר את המדיום הישן של התרבות התא על ידי בעדינות הטיית הלוח תרביות רקמה. ובכן 6 או 12-ובכן וכ רפה בעברית המדיום התרבות תאים עם פיפטה. במהירות להחליף בינוני התרבות העתיקה תא 1 מ”ל של התא טריים תרבות בינוני מאת pipetting אותו בכל טוב.הערה: ניתן לבצע זאת ללא הפסד משמעותי לאחר התאים מותר לפעול ולהתבטא באופן רופף למשך 30-45 דקות לפני להחלפת המדיום התרבות תאים. להוסיף 10 µg/mL של dsRNA זה נוצר בעקבות פרוטוקול מפורט רוג’רס, רוג’רס6 מאת pipetting זה ישירות לתוך המדיום תרביות רקמה של כל טוב של תאים לכל תנאי RNAi. חזור על הליך זה מדי יום, מחליף המדיום התרבות תאים עם mL 1 בינוני טריים ו- µg/mL 10 של dsRNA לכל תנאי RNAi.הערה: RNAi ניסויים בדרך כלל מבוצעות עבור 7 d; עם זאת, העיתוי המדויק תלויה חלבון מחזור והיעילות של dsRNA. RNAi טיפולי קצר ככל בתלת-ממד לרוקן ביעילות תאים של חלבונים מסוימים, בעוד מטרות נוספות דורשים טיפולי ארוך6. 3. ערפל ייצור, הקציר קנה המידה של הצמיחה של S2:Fog-Myc תאים בכך שהוא מאפשר להם לגדול ללא הפרעה במשך 4-8 d כדי לקבל כמעט 100% 75 ס מ confluent2 בקבוקון של תאים ב- 10 מ”ל של תא תרבות בינוני (או לחלופין, בקבוקון 150 ס מ2 ב- 20 מ של התא תרבות בינוני) מקסי למערכות הייצור ערפל. הוסף µL 50 100 מ מ CuSO4 (או µL 100 מ”מ CuSO4 עבור בקבוקון 150 ס מ2 ) על כמעט 100% confluent 75-ס”מ2 . הבקבוק עבור אינדוקציה של האמרגן metallothionine. תקופת דגירה של 48 שעות בטמפרטורת החדר. להסיר המדיום ערפל-Myc-המכיל הבקבוקון תרביות רקמה באמצעות pipetting, להעביר אותו צינור חרוטי 15-mL או 50-mL. צנטריפוגה ב x 2,500 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות לנקות את המדיום של תאים ופסולת הסלולר. להעביר את המדיום התא צינור חרוטי ולשמור על זה על קרח. עבודה בקבוצות, להעביר 5 מ של המדיום שנוקה 15 מ”ל של ריכוז 3,000 מגה-וואט עם ממברנות תאית regenerated, centrifuge זה ב 2,500 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בכל פעם, כדי לרכז את המדיום.הערה: לחלופין, רכז עם קיבולת אחסון גדולה יותר יכול להיות משומש (50 מ”ל). במהלך הריכוז, בינוני בצבע כהה יותר, אשר מועשר ערפל, יתחילו לבנות בחלק התחתון של המסנן בצורת V. להוסיף את הטיפ פיפטה לתחתית ה וי של במסוע ואני מסיר את המדיה בצבע כהה יותר בין כל סיבוב של צנטריפוגה להעביר אותו צינור microfuge 1.7-mL טריים. לשמור על התקשורת על קרח. שימוש במסוע אותו, חזור על השלבים 3.4 ו- 3.5 על-ידי הסרת את צבע כהה יותר מרוכז ערפל-Myc מדיה והחלפתו יותר precleared בינוני, עד המדיום היה מרוכז 1/10th של הנפח המקורי שלה (כלומר, 1 מ”ל מ 10 מ”ל של חומר המוצא). לאחסן את Myc-הערפל מרוכזת ב 4 º C.הערה: לאחר אחסון, להיות בטוח לפקח על זיהום חיידקי, אשר עלולים להיגרם כתוצאה ממושכות של אחסון. לבצע מרחביות-דף על ידי ערבוב µL 10 בינוני פוג-Myc מרוכז עם 10 µL של מאגר המכיל מרחביות denaturing כדי ליצור את lysate. להפעיל את הג’ל מרחביות-עמוד 35 אמא עבור ה 1 להעביר את הג’ל קרום ניטרוצלולוזה (או לחלופין, קרום PVDF) עבור h 1-120 mA. לבצע את תספיג חלבון באמצעות כל נוגדן Myc זמינים מסחרית כדי לזהות להקה 150-kDa.הערה: הריכוז של ערפל-Myc במדיום ממוזגים יכולה להשתנות לפי אצווה. זה לא הכרחי כדי לקבוע ריכוז המדויק של ערפל-Myc על מנת לבצע את הבדיקה, אך היעילות של כל אצווה צריך להיבדק לפני ביצוע ניסוי. השלבים הבאים 3.1 3.2, להכין את הפקד ממוזגים-S2 מדיה על ידי איסוף 10 מ”ל בינוני התרבות תאים מבקבוק כמעט 100% confluent 75 ס מ2 תאים S2 (או, לחלופין, 20 מ”ל מבקבוק 150 ס מ2 ) על ידי pipetting. העברת הפקד S2 תא תרבות בינוני צינור חרוטי 15-mL או 50-mL טריים. השלבים הבאים 3.4-3.7, לנקות את lysate של תאים ופסולת התאית על ידי צנטריפוגה (ב 2500 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בכל פעם) ואז להעביר את התא lysate ריכוז, centrifuge להם להתרכז המדיום שליטה בקבוצות כדי 1/10th האחסון המקורי.הערה: יישום של התקשורת ממוזגים-S2 לא להוביל בתא משמעותיים contractility ב וזמינותו. חנות התקשורת מרוכז של שליטה S2 ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.הערה: לאחר אחסון, להיות בטוח לפקח על הזיהום. 4. הכנה של מנות תת Concanavalin A-מצופים, את ציפוי של S2R + תאים להפוך 10 מ”ל של concanavalin פתרון (con A) על ידי המסת 5 מ”ג של קון A לתוך 10 מ”ל מים עבור ריכוז סופי של 0.5 מ”ג/מ”ל. Aliquot פתרון זה נוח יותר באמצעי אחסון (µL 500 מ ל 1) ואחסן אותו ב-20 ° C. להכין מנות תת 35 מ מ על ידי ציפוי החלק זכוכית של כל מנה עם 200 µL של הפתרון con A, דגירה המנות למשך כ 2 דקות בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה. בשלב הבא, להסיר כל פתרון A קון (אשר יכול להיות נשמר, לעשות שימוש חוזר לניסויים עתידיים) ולאפשר את הכלים מילה נהדרת לחלוטין.הערות: ניתן להכין בקבוצות גדולות ומנות ניתן לאחסן עד 6 חודשים במקום יבש כמו מגירה ספסל מעבדה. להוסיף כ- 2 מ ל תא טריים תרבות המדיה כל מנה עם תחתית זכוכית. Resuspend התאים S2R + להיבדק על ידי וזמינותו ע י pipetting המדיום התרבות תאים למעלה ולמטה, משתמש בו כדי לנתק באופן רופף adhering תאים. העברת תאי S2R + resuspended 35 מ מ תת הכלים המכיל המדיום תרבות תא טרי ולכן הם בין 50-70% confluent. בדוק את צפיפות התאים תחת המיקרוסקופ תרביות רקמה על ידי התמקדות למעלה ולמטה דרך מספר מישורים של התאים מושעה במדיום כדי לקבל הערכה של מספר התאים.הערה: באמצעות ניסוי וטעייה, הצפיפות המתאים של התאים הדרושים על מנת להגיע confluency 50% – 70% יכולה להיות מושגת. לאפשר את התאים לצרף קון-A-מצופה תת מנות למשך 45-60 דקות.הערה: באופן מלא מצורף S2R + תאים מופיעים ‘מטוגן ביצה-כמו’ שעברו שיטוח, שלב-כהה. 5. יעילות הבדיקה של המדיום ממוזגים ערפל, ואת וזמינותו Contractility הסלולר אם רצונך בכך, לאשר התשואה של ערפל-Myc והופק מרוכז מ S2:Fog-Myc יציבה תאי שורות עמודים מרחביות, סופג המערבי. להוסיף 10 µL מרחביות המכיל מאגר מדגם µL 10 של מרוכז ערפל-Myc ומרתיחים אותו במשך 5 דק בצע את מרחביות-דף רגיל והפרוטוקולים המערבי סופג, כתם על אנטי-Myc לאשר ערפל-Myc הייצור. להסיר את כל מגן, שרו M3 בינוני מתאי המצורפת S2R + מ שלב 4.3 על ידי בעדינות pipetting, ולהוסיף בזהירות חזרה 75 µL בינוני מגן, סאנג טריים כדי להגביל את כמות בינוני פוג-מיזוג בשימוש. להוסיף µL 75 של מדיה ממוזגים ערפל לחלק זכוכית של המנה תת שלב 5.2 להביא את הנפח הכולל µL 150, ביחס של 1:1 של מדיה ממוזגים ערפל מגן ומדיה M3 שרו.הערה: הנפח הכולל של 150-200 µL נדרשת כדי כיסוי מלא של חלק זכוכית מאכל טיפוסי עם תחתית זכוכית; עם זאת, זה יהיה תלוי הממדים של המנה תת בשימוש. נטר את contractility של התאים על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שלב באמצעות 20 X או 40 X הגדלה להתבונן שדה שלם של תאים. מעקב אחר המורפולוגיה של תאי וחפשו את התבנית לסירוגין של שלב כהה ואור שלב מתעסקת. מצביע על שינוי צורה.הערה: היישום של ערפל בדרך כלל מוביל ל 30% – 50% של תאים S2R + שעברו לתעוקה הסלולר, לאחר 10 דקות, והתאים מתחילים להירגע, חוזר מורפולוגיה בעלות להב חלק, מטוגן-ביצה-כמו שלהם. נטר את היציבות של contractility הסלולר. אם התגובה תא חזק מאוד באמצעות יחס 1:1 של ערפל ממוזגים בינוניים עד בינוני טריים מגן, סאנג, להפחית את כמות ממוזגים ערפל בינוני כדי לשמר את המדיום ערפל-Myc מרוכז לניסויים עתידיים. השתמש בינוני פוג ממוזגים מדולל אם יחס של 1:1 לא תוביל לתעוקה הסלולר חזקים; בדרך כלל, יחס של 1:3 מפיק תגובה מספיק כדי לבצע בהצלחה את הניסוי.הערה: לאחר היחס המתאים בין ממוזגים ערפל בינוניים עד בינוני טריים מגן, סאנג הוא הוקם לכל נתון צרור בינוני פוג ממוזגים, השתמש יחס זה לניסויים אחרים. נטר שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II dynamics במהלך וזמינותו contractility הסלולר באמצעות יציבה S2R + תא הקו מבטא GFP מתויג רגולטוריות שרשרת אור (S2R +: Sqh-EGFP). באמצעות היחס הוקמה בינוני פוג ממוזגים לבינונית מגן ו- M3 שרו טריים מצעדי 5.2-5.5, הסר תרבותי תא בינוני עם פיפטה ולהוסיף בינוני מגן, סאנג חוזרים רעננים בחלק זכוכית של המנה עם תחתית זכוכית. Perfuse ממוזגים ערפל בינוני ביחס קבוע מראש בעת רכישת רצף תמונות של תאים חיים; . שמור על עצמך כדי לא להזיז את המנה עם תחתית זכוכית במהלך זלוף. 6. תיקון, צביעת תאי S2R מכווץ + לתקן S2R + תאים באמצעות פתרון paraformaldehyde 10% במאגר PEM (100 מ מ צינורות, 1 מ”מ EGTA, 1 מ MgCl2, pH 6.9).הערה: מאגר PEM מתבצעת בדרך כלל-2 x מניות פתרון, ניתן לאחסן במשך חודשים-4 מעלות צלזיוס. להסיר את המדיום תרבות תא מתאי שטופלו ערפל S2R + על ידי pipetting, מיד להחליף אותו עם mL 1.5-2.0 של 10% paraformaldehyde פתרון. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: תאים קבוע יכול להיות מאוחסן קיבוע פתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים; עם זאת, חשוב כי הקיבעון 15-מין הראשונית נעשית בטמפרטורת החדר לפני העברת תאי 4 ° C. להסיר את הפתרון 10% paraformaldehyde על ידי pipetting, החשיפה של המוצר הזה-פסולת אורגנית כראוי. יש לשטוף את התאים על ידי בעדינות pipetting 1.5-2.0 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) למנה תת 35 מ מ. הסר את PBS הישן על-ידי pipetting ולהחליף אותו עם mL 1.5-2.0 ל- PBS טריים 2 x יותר כדי להסיר הפתרון קיבוע שיורית.הערה: חשוב כי התאים לא לייבש מנקודה זו בפרוטוקול. לחסום את התאים כ-200 µL של 5% עז נורמלית בסרום מדולל ב- PBS זה בתוספת דטרגנט ללא יונית 0.1% (PBST) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: בדרך כלל, פתרונות חסימה מכילים נסיוב המתאים האורגניזם שהנוגדנים משני גדלים. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי לדלל אותה ב- PBST. השתמש נפח של 200 µL לכסות לחלוטין לחלק המנה עם תחתית זכוכית זכוכית. להסיר את הפתרון חסימה על ידי pipetting ולהוסיף את הפתרון נוגדן ראשוני ישירות לחלק זכוכית של המנה. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר או, לחלופין, דגירה בין לילה ב 4 º C. כאשר המקננת בן לילה ב 4 ° C, לעטוף את המנה עם תחתית זכוכית 35 מ מ עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות. להסיר את הפתרון נוגדן ראשוני על-ידי pipetting ולשטוף את התאים על ידי pipetting mL 1.5-2.0 ל- PBS טריים למנה תת 35 מ מ. להסיר PBS על-ידי pipetting ולהחליף אותו עם mL 1.5-2.0 ל- PBS טריים 2 x יותר. הכן פתרון של משני נוגדנים על ידי לדלל אותה ב- PBST. נפח של 200 µL מספיקה לכסות רק את החלק זכוכית של המנה. הוסף את הפתרון נוגדנים משניים ישירות לחלק זכוכית של המנה. דגירה התאים עם נוגדנים משניים פתרון עבור h 1 בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב 4 º C. לעטוף את המנה 35 מ מ עם מצלמות-מיקרוסקופים אם המקננת כל לילה כדי למנוע התאיידות. להסיר את הפתרון נוגדנים משניים על-ידי pipetting ולשטוף את התאים עם PBS מאת pipetting mL 1.5-2.0 ל- PBS טריים למנה. הסר את PBS הישן והחלפתו 2 x יותר, בעקבות הליך זה זהה. לשמר את התאים קבוע, מיטה על-ידי הוספת מספיק בינוני הרכבה פלורסנט אנטי-לדעוך כדי לכסות את החלק זכוכית של המנה 35 מ מ עם תחתית זכוכית. אחסן את הדגימות ב 4 ° C, והרחק אור.הערה: האות פלורסנט לאט תרקב החודשים גם אם נשמרת כראוי. לקבלת תוצאות מיטביות, תמונה בתוך שבוע. 7. הדמיה של כימות וזמינותו Contractility הסלולר תמונה קבועה S2R + תאים באמצעות תקן הפוך בסיוע מיקרוסקופ אור עם שלב ניגודיות, DIC או קרינה פלואורסצנטית יכולות הדמיה. באמצעות 20 X או 40 X הגדלה, לכידת 10-30 שדות תמונה ללא חפיפה של תאים בהתאם צפיפות התאים, עם המטרה של רכישת התמונות של 200 או יותר תאים לכל תנאי. באמצעות מונה תא סטנדרטי, לספור והקלט מספר מכווצים (שלב-כהה, bonneted תאים) ותאים noncontracted לפי כל שדה בשבי.הערה: זה הכי טוב שיש שני חוקרים לקחת סעיפים עצמאית של תאים noncontracted ומתפשט לכל שדה, או לחלופין, החוקר אותו יכול לסמוך באותו שדה תמונה של תאים שלוש פעמים, המאפשרות מספר ממוצע של חוזה, תאים noncontracted לכל שדה לחשב. הכן מספר con A-מצופים תת מנות לכל תנאי הניסוי כפי שמתואר בשלב 4.2. פיפטה למעלה ולמטה המדיום התרבות התא כדי לסלק תאים S2R +: Sqh-EGFP באופן רופף חסיד בכל צלחת אותם אז הם 50% – 70% confluent במנות תת 35 מ מ. לאפשר את התאים לצרף במשך 30-45 דקות. התמונה S2R +: Sqh-EGFP תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ספינינג-דיסק, סחף-שדה, או על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות באמצעות 60 X – 100 X הגדלה. הסר בינוני כל מגן, M3 שרו המנה עם תחתית זכוכית המכיל תאים S2R +: Sqh-EGFP המצורף. Perfuse על יחס קבוע מראש של בינוני פוג-Myc ממוזגים לבינונית מגן ו- M3 שרו טריים מן השלבים 5.2-5.5 ישירות על גבי החלק זכוכית של המנה תת באמצעות פיפטה, בזהירות כדי שלא להפריע את המיקום של המנה על המטרה. לרכוש תמונות למשך 12-15 דקות על מנת ללכוד את החניכה, התכווצות מלא של התאים S2R +: Sqh-EGFP.הערה: אם צביעת שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן או צולבות הקישור חוטים שרירן-pRLC, היווצרות של טבעת צולבות הקישור חוטים שרירן חזק על פני השטח של התאים הוא גם מרמז על contractility. אם הדמיה S2R +: Sqh-EGFP תאים חיים, ה-RLC מתויג EGFP יהוו דומה חזק טבעות (ראה איור 3) מצביע על כך contractility. השינוי צורה המתרחשת יגרמו התאים “בונה”, תופסת צורה תלת ממדית; מישור המוקד על המיקרוסקופ ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי לעקוב אחר שינוי צורה זה התא. תחת בקרת תנאי RNAi, בדרך כלל, 30% – 50% של התאים עוברים הכיווץ על התוספת של ערפל. שימו לב כי כמה תנאים RNAi עשוי להוביל ההתכווצות בהיעדרו של ערפל.

Representative Results

S2 ו- S2:Fog-Myc התאים גדלו עד סמוך confluent תנאים בבקבוקון תרביות רקמה 150 ס מ2 ו שטופלו 25-75 מיקרומטר CuSO4 על פני תקופה של 24-48 שעות כדי לגרום ביטוי של ערפל-Myc (איור 2). דגימות תאים S2 (איור 2א) ו- S2:Fog-Myc תאים (איור 2B) הוסרו ו ערפל-Myc הייצור היה בפיקוח תספיג חלבון. כצפוי, נכשלנו לזהות ערפל-Myc בתקשורת שנקטפו מתאי S2 בשום תנאי. עם זאת, גילו ערפל בתקשורת שנקטפו את S2:Fog-Myc התא יציב קו מוקדם ככל 24 שעות לאחר אינדוקציה עם מיקרומטר 75 CuSO4. S2R + תאים מחוברת con A-מצופים תת מנות ביטוי מתויג EGFP תקינה אור בשרשרת (GFP-RLC) של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II (דמויות 3A ו- 3B). בוצעה הדמיה לחיות תאים במיקרוסקופ הפוכה מצויד 100 X / 1.4 נה עדשה המטרה במהלך זלוף של מדיה ממוזגים ערפל. כ 5 דקות שלאחר הטיפול עם ערפל-Myc, ה-RLC נוצרו טבעות מעידה על שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II הכיווץ. טבעות אלו ניתן לצפות דרך immunostaining S2R + תאים עם נוגדן יותקף phosphopeptide סינתטי המתאים שאריות סביב Ser19 של האדם צולבות הקישור חוטים שרירן RLC (דמויות 4A , 4B). נוגדן זה cross-reacts עם דרוזופילה RLC. יש לנו כאן דוגמה ייצוגית וזמינותו contractility הסלולר בעקבות טיפול 7 ימים של תאים עם שליטה RNAi dsRNA נגד Rho1 (דמויות 5A – 5E). S2R + תאים מצופים על קון-A-מצופה מנות תת, שטופלו ממוזגים ערפל (+ ערפל) מדיה או בקרת מדיה (-ערפל). מספר התאים מכווצים היו אז לכמת בעקבות קיבעון. הראשון קפלים צפוף שלב הכיווץ הייתה בולטת בתאים שליטה דלה שטופלו מדיה ממוזגים ערפל (איור 5B). איור 5C, מדולדל רו תאים שטופלו בינוני ממוזגים-S2 הם דוגמה טיפוסית של בעלות להב חלק, מטוגן-ביצה-כמו מורפולוגיה. שימו לב כי רו ממלא תפקיד מסלול איתות ערפל, וכן ציטוקינזה; לפיכך, תאים מדולדל רו לעיתים קרובות אינם מצליחים לחלק כראוי, מובילה לעלייה פלואידיות וגודל תא. טיפול של שליטה מדולדל תאים ממוזגים ערפל מדיה טיפוסי מוביל ל 30% – 50% של תאים שעברו הכיווץ, ואילו נכשלנו להתבונן לתעוקה משמעותית בתאים מדולדל רו. איור 1:הערפל בשם איתות. בהיעדרו של ערפל, יחידת משנה12/13 Gα, מפוחית יד (Cta), יחד עם שותפיו איגוד Gϒ ו- Gβ, אינם פעילים המשויכים קולטני משותפת הערפל ואת הערפיח. ריק-8 מתלווה לשמור Cta ומסדיר לוקליזציה subcellular שלה. על ערפל מחייב, Cta disassociates מ Gϒ ו Gβ המתגייסים RhoGEF2 את קרום התא שבו זה מזרז את ההחלפה של התוצר המקומי הגולמי עבור GTP ב GTPase Rho1 קטן. GTP-מחויב Rho1, פעיל כעת, מפעיל קינאז רו (רוק), אשר phosphorylates ה-RLC של שרירים שאינם צולבות הקישור, מחוז חוטים שרירן, המוביל שלה הפעלה contractility הסלולר עוקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : הזמן-קורס הפקת ערפל-Myc. מראות אלה תא תרבות בינוני שנקטפו בקבוקון ליד של confluent 100% של תאים שליטה S2 (A) או S2:Fog (B)-Myc תאים יציב. התאים טופלו על-25-75 מיקרומטר CuSO4 על פני תקופה של 24-48 שעות. המדיום התרבות התאים שנאספו, מוכנים מרחביות-דף סופג המערבי. ערפל-Myc זוהה על ידי נוגדן אנטי-Myc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : הדמיה לחיות תאים של הכיווץ ערפל-induced. יציב S2R + שורות תאים ביטוי מתויג EGFP ה-RLC של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II היו עם תמונה על ידי סחף-שדה מיקרוסקופיה קונפוקלית במהלך זלוף של מדיה ממוזגים ערפל. הזמן מוצג דקות ושניות. (א) לוח זה מראה תמונה של מטוס מוקד בקרבת הממשק תא-coverslip בזמן 0:00 לפני זלוף של ערפל-Myc. (B) לוח זה מציג סידרת זמן (0:30-10:00) של תמונות שצולמו מטוס מוקד בסמוך לחלקו העליון של התא. החצים הלבנים מציינים לארגונו מחדש של השרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II כפי שמציין EGFP-RLC לטבעות כויץ בזמן הכיווץ. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : Phosphorylated-ה-RLC. רגישה טבעות כויץ בעקבות אינדוקציה של הכיווץ ערפל-Myc. S2R + התאים היו קבועים, צבעונית אקטין באמצעות phalloidin (אדום), ה-RLC באמצעות נוגדן phosphoserine-19 (ירוק) phosphorylated של דאפי (DNA, כחול), בעקבות טיפול עם שליטה () או (B) מדיה ערפל-Myc-ממוזגים. שימו לב לארגונו מחדש של phosphorylated RLC לטבעות על התוספת של ערפל-Myc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : נציג כימות וזמינותו ערפל-induced contractility הסלולר. S2R + תאים טופלו שליטה (A ו- B) RNAi או dsRNA (C ו- D) נגד GTPase Rho1 קטן במשך 7 ימים. בעקבות הפעם, התאים מצופים על קון-A-מצופה מנות תת וטופלו עם מדיה בקרה (A ו- C) או ערפל-Myc-ממוזגים מדיה (B ו- D). קנה המידה של בר מייצג 10 מיקרומטר. (E) של פיזור מגרש מציין את מרווחי הביטחון mean ו 95% של השבר תאים ומתפשט לכל תנאי. נקודות בודדות לייצג את השבר של תאים ומתפשט לכל שדה הראיה בהגדלה X 40 (10-120 תאים לכל שדה) ואת המספרים בסוגריים מציינים שהמספר הכולל של תאים נחשבו תאים מכווצים והן שאינו מתכווץ נפרד מעל שלוש RNAi ניסויים. הכוכביות מציינות הבדל משמעותי סטטיסטית בין תנאי RNAi, ערפל-שטופלו כפי שנקבע על ידי חד-כיווני אנובה (p < 0.0001) עם ניתוח השוואה פוסט הוק מרובים של Tukey. שימו לב כי היה הבדל משמעותי סטטיסטית (נ. ס) בין דגימות שטופלו Rho1 RNAi מטופלים עם שליטה או עם מדיה ערפל-Myc-ממוזגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור וזמינותו contractility מבוססת תא באמצעות דרוזופילה תרביות רקמה קו תא (S2R + תאים), אשר עובר שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן לתעוקה II בתגובה ערפל איתות. Assay זו שימושית עבור חוקרים את מסלול ערפל, וכן מנגנונים המסדירים שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility.

תא culturing שיקולים:
התנאים תחת אילו S2R + תאים נשמרים חיוני להשגת נתונים אמין זה וזמינותו. בעת תכנון לבצע את הבדיקה contractility, זה הכי טוב לשמור על S2R + תאים במדיום חרקים מגן ו- M3 שרו. בעוד S2R + תאים יכולים לשגשג בתקשורת תרבות אחרים תא חרקים (למשלSF900 או של שניידר חרקים בינוני), הם לעיתים קרובות מאבדים את ההיענות שלהם כדי ערפל. S2R + תאים המכילים מספר מעבר גבוה, בדרך כלל יותר מ 20-25 קטעים, מתחילים להפסיד רגישות RNAi. עדיף להשתמש במעבר מוקדם תאים עבור כל הניסויים. היבט חשוב נוסף ולניסויים דלדול RNAi היא בחירת הפקדים המתאימים. פקדים שלילי נפוצים כוללים dsRNA מיקוד EGFP או pBlueScript, וגם את אשר יש לי הומולוגיה כדי הגנום לעוף. פילוח חלבונים במסלול ערפל (רו, רוק, וכו ‘), אשר, כאשר דלה, למנוע את ההפעלה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility, הם גם פקדים שימושיים. S2:Fog-Myc תאים יכול להישמר במדיום תרבות התא אלטרנטיביות כגון SF900 בתוספת 100 יחידות/mL הפניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, ו 0.25 שהוא גוסס ב’ הערה FBS הזה נדרש לא כאשר culturing בתאים SF900. תא צפיפות היא גם מרכיב קריטי לכל ההיבטים של תאים תרביות רקמה דרוזופילה . בניגוד תרביות רקמה בתרבית של תאים, דרוזופילה-תרביות רקמה נגזר תאים לשגשג הטוב תחת צפיפויות תא גבוה יותר (צפיפות לא נמוך מ 5 x 105 תאים/מ ל…). עם זאת, בעת ביצוע וזמינותו הזה, זה קריטי כי תאים לא מצופה ב- con A-מצופים מנות עם תחתית זכוכית מעל 80% הנהרות, כפי כימות של חוזה לעומת תאים שאינו מתכווץ מאוד מייגע

היבטים קריטיים, גישות אלטרנטיביות של וזמינותו Contractility הסלולר:
הייצור של ערפל, ליגנד שמפעיל שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility, היא מרכיב מרכזי של זה וזמינותו. הגן ערפל מקודד חלבון של חומצות אמינו 730 עם משקל מולקולרי החזוי של ~ 78 kDa26. ניתוח hydropathy גילה רצועה של שאריות הידרופובי 12-הערפל אמינו-terminus יכול לתפקד כרצף הפרשת אות. בנוסף, רצף קידוד מכיל גם באתרים מרובים עבור פוטנציאל גליקוזילציה N-O-מקושרים, נוסף רומז שערפל הוא חלבון המופרש26. כדי לתמוך בזה, ערפל מקומי שלפוחית הפרשה הרב, שעורר תאים באפידרמיס בתהליך הכיווץ הפסגה16. ערפל-Myc ביטוי הושרה על תוספת של נחושת גופרתית למדיום, נוגדנים נגד ערפל או Myc מוכר חלבון 150-kD מאמצעי התרבות שנקטפו מתרבויות המושרה אבל לא מ המושרה מדיה מתאי S2 חסר הבונה ערפל-Myc. משקל מולקולרי הזה היה גבוה יותר מאשר המשקל המולקולרי של 80-kD החזוי של ערפל, מרמז כי המנגנונים הפרשה של תאים S2 עשוי glycosylate החלבון לפני אקסוציטוזה. לאור ההשתנות פוטנציאליים טיהור ערפל, רצוי להשתמש מאותה אצווה של ערפל ממוזגים מדיה עבור כל הניסויים. ממציא גדול אצוות של מדיה ערפל-Myc מרוכז תסייע בשמירה על עקביות לאורך כל הסיבובים של ניסויים.

ההצלחה של assay זו תלויה גם בביטחון זיהוי תאים שעברו הכיווץ. בעוד תאים מכווץ יכול להיות שנצפו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, על ידי צביעת אקטין או שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II, הדרך האמינה ביותר כדי לזהות ולכמת תאים מכווץ הוא דרך שלב-ניגודיות או מיקרוסקופ DIC. ספירות מדויק יכולה להיות מושגת באמצעות 20 X – 40 X הגדלה על מיקרוסקופ אור רגיל ביותר. למרות בפרוטוקול נכתב משתמשת כאן מנות תת, וזמינותו ניתן גם לבצע באמצעות תקן 1.5 coverslips זכוכית דקה מצופה con א התוספת של ערפל יכולה להיעשות 35 מ מ של תרביות רקמה על coverslip מניחים על מצלמות-מיקרוסקופים, כדי להגביל את כמות ערפל המשמש עבור כל וזמינותו. האיכות של קיבעון הוא מרכיב קריטי וזמינותו, כפי תאים גרוע קבוע יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות. באמצעות פתרון קיבוע טריים ולוודא התאים לא יבש מתקבעת יוביל תוצאות אמינות יותר. לבסוף, חשוב לספור את מספר גדול של תאים. בדרך כלל, רק 30% – 50% של מטופל או תאים שטופלו RNAi שליטה מתכווצים בעקבות זלוף של ערפל. עם זאת, יש רמה הבזליים של הכיווץ המתרחשת ב- S2R + תאים, כך מספר גדול של תאים יש צורך להבטיח כל שינוי השבר תאים מכווץ עקב טיפולים. יתר על כן, דלדול של כמה חלבונים מעורב ברגולציה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility עלול להוביל hyper-contractility, גם בהיעדר של ערפל. הנתונים המובאים כאן הם מעל התאים 3,600 נמנו שלושה טיפולים רצופים RNAi באמצעות מאותה אצווה של מדיה ממוזגים ערפל.

יישומים של וזמינותו Contractility הסלולר:
זה וזמינותו contractility, בשילוב עם RNAi הקרנת שיטות, מציע מערכת חזקה ללמוד איתות התא, מורפוגנזה ו contractility הסלולר. בעבר, זה שימש כדי לזהות אחד של ערפל שני רצפטורים שיתוף21. מסך יישוב של 138 G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) תיגמר ידי RNAi S2R + בתאים, יכולתו להגיב הערפל היה לבדיקה כמפורט בפרוטוקול המוצג כאן. של GPCRs 138, יחיד, ג’ין uncharacterized בעבר, כיום ידוע ערפל, נחשפה. חקירה נוספת הפונקציה של ערפל הוכיח כי לא רק היה זה נדרש עבור ערפל-induced contractility התאית בתאים S2R +, אבל זה גם היה חיוני gastrulation בפיתוח דרוזופילה21. יתר על כן, וזמינותו הזה שימש כדי להדגים כי ריק-8, של גף קאנונית, היא גם מרכיב בערפל איתות לשביל27. סדרה של ניסויים RNAi אפיסטזה בשילוב עם וזמינותו contractility הפגינו ריק-8 אינטראקציה עם יחידת משנה12/13 Gα Cta, פונקציות כדי לאתר אותו בתוך התא, אשר הינה קריטית ערפל-induced contractility הסלולר31 .

תרביות רקמה דרוזופילה הוא מתאים במיוחד טירונים, התאים נשמרים בקלות בטמפרטורת החדר, אינם דורשים CO2 או buffered תא תרבות בינוני, מוצקים כל עוד התא הנכון תרבות צפיפויות נשמרים. וזמינותו contractility הסלולר בוצעה בהצלחה באמצעות המקטע מעבדה של קורס ביולוגיה לתואר ראשון תא, שבו התלמידים היו ללא ניסיון עם תאים culturing או מיקרוסקופ. וזמינותו contractility הסלולר המובאת כאן מייצג כלי רב עוצמה, המבוססים על התא יכול להיות מועסק גילוי הגן, או לחקור את הערפל איתות, עוזר לנו טוב יותר להבין תהליכים התפתחותיים, כגון לתעוקה הפסגה ו שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility II, באופן כללי.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות חברי המעבדה רוג’רס, המעבדה אפלוויט גרטה גלובר, הסטודנטים של המכללה ריד האביב 2018 קורס ביולוגיה תאית, שתרמו להתפתחות של פרוטוקול זה. יתר על כן, המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ריץ בקפידה קריאה ועריכה של כתב היד הזה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מספר פרס 716964 D.A.A., ע. ר, המחלקה לביולוגיה של המכללה ריד.

Materials

S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, undergoes apical constriciton
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Tags

Non-muscle Myosin IIContractilityFolded-gastrulation Signaling PathwayDrosophila S2R+ CellsCell-based AssayCell DensityCell MorphologyCell Shape ChangeMorphogenesisDevelopmentGene DiscoveryRNAi Depletion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image