人間-iPSC 由来心筋細胞分離の収縮測定 384 ウェル プレートの温度制御の Ca 感受性蛍光色素

1. セル板の準備 注: は、4 週間前に薬剤の効果の測定セル板 3-を準備します。 実験の日 0注: 実験 28 日 22-の間の任意の日のプランニングのためテスト複合アプリケーションを実行できます。 37 ° C で風呂の水をオンにし、めっき中の 40 mL (製造元によって提供される) を暖かい。注: は、サプライヤーが提供した一致する文化や保守メディアでセルを使用します。 雪解けによる CM の 2 分間水浴の凍結細胞を含む cryotubes を配置することによって。 50 mL の円錐管に 1 mL の細胞懸濁液を慎重に転送します。 1 ml の残りのセルの取得しステップ 1.1.3 を含んでいるセルから同じ円錐管に洗浄メディアを追加暖かいめっき中の各 cryotube を洗ってください。 細胞懸濁液に暖かいメッキ媒体の慎重に別の 8 mL を混ぜます。 トリパン ブルー色素排除法と hematocytometer8を使用して生きているセルをカウントします。注: 6 x 106の要件細胞 1 つ 384 ウェルの細胞板凍結細胞の間で最大 20% の死んだ細胞の可能性を熟考します私たちの経験では最大であるため。 5 x 105ライブ セル/mL に暖かいめっき中に細胞懸濁液を調整します。 25 μ L を各ウェル (ウェルあたり約 12,500 セル) に追加することによって、2 つセル 384 ウェルプレートに細胞懸濁液を配布します。注: セル板は、任意の行列にプレコートする必要はありません (ディスカッションを参照してください)。 37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気でセル板を維持します。 実験の日 1 37 ° C および 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の暖かい 50 mL で風呂の水を入れます。 セルのプレートの各ウェルに暖かい培地の 50 μ L でメッキ媒体を交換してください。 実験 (27 日) まで 21 日間 2-注: による CMs 必要はありません任意のこの期間に、継、非分裂細胞。 3 日間すべての 2-を更新維持培地の半分と 7、14、21 日に更新します。注: 22 と実験の 28 日間蛍光測定を実行できます。長い期間は試みられていないが、罰金があります。 2. 計測器、複合板、アッセイ プレートの準備 注: 計測器、複合板を準備し、アッセイ プレートの 22 と実験の 28 日間の薬剤の効果の測定の日。温度制御と適切な蛍光フィルター キットと励起光蛍光プレート リーダーを使用してソース。たとえば、蛍光-3/蛍光色/蛍光-8 4 蛍光フィルター キットを使用 (励起: 472 nm; 発光: 520-560 nm) と 150 W 励起光源ユニット。 測定用のプレート リーダー内に配置されます最初の細胞板が前に少なくとも 2 時間はリーダーをオンにし、37 ° C で加熱システムを設定注: これはまた前に、の晩を行うことが。 それぞれ、DMSO、DMSO、10 mM と、H2O で 3.33 mM 0.33 mM の原液として肯定的なコントロール、フォルスコリン、N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンおよび E-4031 を準備しています。注: 在庫ソリューションを 333-fold 希釈が時間によってセルに追加され、目的がおよぼすフォルスコリン 1 μ M、30 μ M N6-シクロペンチルホモログ-アデノシンと 10 μ M の最終的な試験濃度を達成することです E-4031 は、信頼性と再現性のある効果を生み出します。 333-fold、予定していたテスト濃度 (例えば、30 μ M でのテストの 10 の mM) で DMSO 溶液として 352 テスト混合物を準備します。注: 目的化合物の応用; 後 0.3% (v/v) DMSO セル板の最終的な集中を達成するためにはこれは、心筋細胞の律動に影響しない最高の DMSO 濃度です。溶液は、前日も用意できます。原液の 5 μ L の最小重複測定ごとに必要です。 複合板を準備します。 部屋の温度に 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の 40 mL を温めます。 ウェルあたり原液 1.5 μ L を追加することによって 2 つの複合 384 ウェル プレートに配布: i) テスト化合物 (それぞれの 2 つの井戸)、ii) 肯定的なコントロール (フォルスコリン、N6-シクロペンチルホモログ-アデノシン、E-4031、複合板あたり 4 井戸)、iii) 負コントロール (DMSO、複合板あたり 20 井戸)。 複合板 1 分 100 × gで遠心分離機します。 室温でメンテナンス中の 37 μ L を各ウェル (その段階で 38.5 μ L で 3.9 %dmso) に追加します。 複合板 1 分 100 × gで遠心分離機します。 複合板をプレート リーダーに読み込みます。注: 次の手順は、複合板の蒸発を最小限に抑えるため、できるだけ早く実行必要があります。 蛍光染料を準備します。 37 ° C および 1 %v/v ペニシリン ストレプトマイシン溶液を添加した培地の暖かい 100 mL で風呂の水を入れます。 Ca 感受性蛍光色素と抗生物質で暖かい培地 10 mL でクエンチャを再構成します。注: Ca 感受性蛍光色素、通常蛍光-4、および、逆にこのストック蛍光媒体が含まれ、残ったを少なくとも 5 日間の 4 ° C で保存できます。 3. データ集録 注: 薬剤の効果の測定の日にデータ集録を実行します。最初のセル板完全.10 3.1-の手順を実行し、2 番目のセル板のそれらを繰り返します。 (必要なら) プレート リーダー ソフトウェアを起動し、ピペットのヒントを読み込みます。 各ウェルのベースライン打撃速度を定義する少なくとも 10 ヘルツの取得頻度を持つカルシウム波の 2 分セグメントを記録するソフトウェアの設定を調整します。 1 つのセル板蛍光培地を作るための抗生物質で暖かい培地の 12 mL にストック蛍光媒体の 3 mL を希釈します。 細胞プレートの各ウェル中の 20 μ L を 30 μ L の蛍光媒体に置き換えます。 ミックスに 1 x 上下ピペットします。 セル板をプレート リーダーによる CM の温度に慣らすようにできるだけ早く配置します。 データ集録を開始する前に 60 分待ちます。 各ウェルのレートを破ってベースラインを定義する、少なくとも 10 Hz の取得頻度を持つ Ca 波の 2 分セグメントを記録するプレート リーダー ソフトウェアでデータ集録を開始します。注: 各記録系列細胞板は転送されません自動的にデバイスからデータ取得後を確認してください。これは細胞板が室温で冷却することを防ぎます。プレート リーダー ソフトウェアのいくつかのバージョンでは、それはこれを達成するために完全に終了する前に、各録音を停止する必要があります。 セル板に複合板から井戸-井戸 5 μ L を分注、プレート リーダー ロボット テストおよび参照化合物を追加 (また後、DMSO 濃度は 0.3% [v])。 Ca 波化合物添加について 5、15、30、45、60 分以降のレコード 2 分セグメントにプレート リーダー ソフトウェアでデータ集録を開始 (確認セル板滞在するたびにデバイスで)。 4. データ解析 注: 測定後随時、データ分析を実行できます。 ASCII テキスト ファイルとしてプレート リーダー ソフトウェアからの録音期間ごとに raw データをエクスポートします。 Raw データをデータ解析ソフトウェアにインポートできます。 各ウェルおよびすべての時間のポイントは、プライマリの打撃頻度を抽出します。注: データ分析ソフトウェアで材料の表に記載されている、周波数を破って計算できる最小自乗スペクトル解析7 の小児眼科-Scargle 法に基づく、LombPeriodogram 関数を使用してカスタム解析ルーチンを.6.00 は、0.01 と 5 Hz の間の周波数の範囲の計算する必要があります。主な周波数は、PeakAutoFind ルーチンを使用してピリオド グラムから抽出できます。この分析方法は、プレート リーダー ソフトウェアのオプションとして提供されたメソッドより周波数を破ってのより正確な測定を提供します。ただし、後者も使用できますソフトウェアのカスタマイズは、オプションではない場合。 クリップボードにコピー、または ASCII テキスト ファイルとして、データ解析ソフトウェアからの録音期間ごとにプライマリ暴行周波数をエクスポートします。 表計算ソフトにクリップボード貼り付けまたはテキスト ファイルのインポートによってプライマリ暴行周波数をインポートします。注: 任意の近代的な表計算ソフトで 4.9 4.5-の手順を実行できます。 正規化各ウェルのベースラインに薬剤塗布後の各時点で打撃頻度 (5、15、30、45、および 60 分) その時点で、プライマリ周波数で割って基準で主要な打撃頻度によってポイントします。 薬剤塗布後各時点で平均 DMSO の効果を計算 (5、15、30、45、および 60 分) DMSO が適用された 20 の井戸の正規化した値を平均することによって。 薬剤塗布後ポイント各ウェルの各のため (5、15、30、45、および 60 分) 平均 DMSO 効果 (時間一致) 同じ板を引きます。 重複した測定値の平均値します。注: 化合物生産不整脈かどうか化合物は、周波数を変更またはソフトウェアは、化合物の添加後主な周波数を見つけることができません、打撃パターンの目視検査が評価できます。