تقلصات سينسيتيا كارديوميوسيتي المستمدة من اللجنة التوجيهية الإنسان يقاس بصبغة فلورسنت المراعية لكاليفورنيا في 384-جيدا لوحات التحكم في درجة الحرارة
Summary
التعاقد تلقائياً سينسيتيا كارديوميوسيتيس المستمدة من فعل الإنسان pluripotent الخلايا الجذعية نماذج مفيدة لفسيولوجيا القلب البشري والصيدلة. وهنا يقدم نظام فرز الفائق التحديد الكمي لآثار المركبات الخارجية على ضرب التردد، باستخدام صبغة فلورسنت مراعية لكاليفورنيا وقارئ لوحة متعددة جيدا تصوير التحكم في درجة الحرارة.
Abstract
المتعاقدة عفويا سينسيتيا كارديوميوسيتيس المستمدة من فعل الإنسان pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك سم) نموذج مفيد لفسيولوجيا القلب البشري والصيدلة. قد اقترحت أساليب مختلفة لتسجيل هذا النشاط العفوي وتقييم آثار المخدرات، ولكن العديد من هذه الطرق تعاني من الإنتاجية المحدودة و/أو أهميتها الفسيولوجية. قمنا بتطوير نظام فرز الفائق التحديد الكمي لآثار المركبات الخارجية على ضرب التردد هيبسك-سم، باستخدام صبغة فلورسنت مراعية لكاليفورنيا وقارئ لوحة متعددة جيدا تصوير التحكم في درجة الحرارة. ونحن تصف كيفية إعداد لوحات الخلية ولوحات المركبة وكيفية تشغيل الفحص الآلي لتحقيق حساسية عالية وإمكانية تكرار نتائج. ونحن أيضا وصف كيفية تحويل وتحليل البيانات الأسفار لتوفير تدابير موثوق بها من آثار المخدرات على إيقاع عفوية. يمكن استخدام هذا التحليل في برامج اكتشاف المخدرات للدليل الكيميائي الأمثل بعيداً عن، أو باتجاه، المركبات التي تؤثر على وظيفة القلب البشري.
Introduction
ويصور هذا البروتوكول وسيلة لقياس آثار المخدرات على تواتر ضرب عفوية سينسيتيا هيبسك-سم في إيقاعات فسيولوجيا ذات الصلة. يمكن التفريق بين الخلايا الجذعية pluripotent بشرية في cardiomyocytes الوظيفية التي تنشئ تلقائياً من الضرب سينسيتيا في المختبر1،من2،،من34. ويمكن الحصول على هذه هيبسك-سم بإعداد كبيرة عن طريق مقدمي الخدمات التجارية أو من خلال الإنتاج في المختبر، ومصدر مفيد للخلايا لتوليد نماذج لفسيولوجيا القلب البشري والصيدلة. على وجه الخصوص، يمكن استخدامها للتنبؤ أو لوصف آثار القلب التي قد تحدث عند إدارة مخدرات بالبشر5.
يمكن قياس تواتر الضرب سينسيتيا سم هيبسك تحت الظروف الفسيولوجية استخدام صفائف ميكروليكترودي أو مقاومة الاستشعار1: هذه التقنيات موسع معلومات مفصلة جداً عن آثار المخدرات، ولكنها بدلاً من ذلك الإنتاجية منخفضة، وأنها لا تقم بتمكين اختبار مكتبات مجمع كبير داخل الزمن الواقعي والقيود المتعلقة بالميزانية. يمكن وضع نظام أكثر فعالية لاستخدام fluorescence 384-جيدا التصوير قارئ لوحة وصبغ Ca تراعي6، ولكن القراء لوحة كلاسيكية يعوقها التردد السيطرة واكتساب درجة الحرارة دون الحد الأمثل. يتم توضيح هذه القيود بمعدلات الضرب أونفيسيولوجيكال (~ 15 نبضة في الدقيقة، بالمقارنة مع نبضة في الدقيقة 35 – 55 في البيئات التي تسيطر عليها1)، وضعف القرار إشارة Ca (تردد اقتناء 8 هرتز في الحد الأدنى لمعدلات قياسية يمكن أن تصل إلى 120 نبضة في الدقيقة تحت ظروف حفز، وأنه لا يمكن استخراج المعلومات مثل المنحدر أو المدة). الأسلوب الموصوفة هنا يجمع بين تسجيل ضرب أنماط في إيقاعات الفسيولوجية ودقة كافية للحيلولة دون هذه الشواغل.
على الجانب الإيجابي، هذا الأسلوب هو بسيطة وموثوق بها وعالية الإنتاجية، مما يسمح للاختبار السريع لعدد كبير من المركبات بتكاليف معقولة. على الجانب السلبي، وهذا الأسلوب يتطلب قارئ لوحة سريع مع التحكم في درجة الحرارة الفعالة، واستثمار مكلف، وأنه يوفر آليا إلى القليل من المعلومات عن آثار المخدرات الملاحظة، مما قد يحتم إجراء المزيد من التجارب مع أكثر تفصيلاً أساليب.
هناك حاجة هيبسك6 أبروكسيماتيفيلي 6 × 10 سم لقياس واحد في لوحة الخلية 384-بئر واحدة. يتم عادة توفير سم هيبسك تجارياً كمختبرين المجمدة ~ 4 × 106 خلايا في 1 مل. ولذلك، أنها ملائمة لإعداد لوحات الخلية اثنين مع ثلاث مختبرين المجمدة. وفي معظم الحالات، بسبب تباين منخفض من هذا التحليل، أنها كافية لإجراء قياسات مكررة من المركبات الاختبار، وفي كل لوحة الخلية، كوادروبليكاتي قياسات عناصر إيجابية (فورسكولين و N6-سيكلوبينتيل-الادينوسين و E-4031)، و 20-بليكاتي قياسات مراقبة سلبية ([دمس] وحدها). ولذلك، يمكن تقييمه كحد أقصى من 352 مجمع/تركيز أزواج مع اثنين من لوحات خلية 384-جيدا. البروتوكول التالية تعتبر هذه تجربة إجراء مع 352 اختبار المركبات وهما الخلية ألواح الخلايا 12 مليون الموردة كمختبرين المجمدة الثلاثة؛ ويمكن بسهولة زيادة إذا كانت هناك حاجة إلى نقاط بيانات إضافية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانبين الأكثر أهمية لتسجيل ناجحة لضرب الترددات. الأول توخي الحذر مع الخلية والطلاء والثقافة. من المهم على وجه الخصوص، في محاولة لتجنب خدش طبقة الخلية في الجزء السفلي من الآبار عند تبادل المتوسطة. أنه مقبول للجزء السفلي من الآبار مع الممصات تعمل باللمس، ولكن ينبغي أن تستخدم نفس الزاوية في كل مرة، وبالتالي تنتج فقط خدش صغير في طبقة الخلية ولا تؤثر على أداء الفحص. الجانب الحاسم الثاني من الحصول على إيقاعات متجانسة استنساخه توفير مراقبة درجة حرارة جيدة عند 37 درجة مئوية عبر لوحة الخلية طوال فترة القياس. ونحن لا يمكن الحصول على هذا التجانس باستخدام الأجهزة عدا قارئ اللوحة المستخدمة هنا، ولكن قد يكون ممكناً مع تعديلات خاصة لتنظيم درجة الحرارة: من شأنه أن يجعل البروتوكول المقدمة هنا يمكن استخدامها على نطاق أوسع خارج العلامة تجارية وحيدة للوحة القارئ. لتحقيق استقرار درجة الحرارة طوال فترة التجربة مع الجهاز المستخدم هنا، من الضروري التوقف عن كل تسجيل قبل أن انتهى؛ وبخلاف ذلك، أن إخراج الروبوت لوحة الخلية المقاسة. قد تختفي هذه المشكلة التقنية مع الإصدار التالي من برنامج قارئ لوحة، لكنها لا تزال حرجة الآن. إذا كان يتم نقل لوحة الخلية عن طريق الخطأ خارج لوحة القارئ، يجب تحميل إلى الداخل أسرع وقت ممكن. ومع ذلك فسوف تتدهور نوعية التجربة، نظراً للتغيرات في درجة الحرارة تؤثر على معدل الضرب سرعة فائقة.
قد تكون بعض الجوانب الأخرى، التي لم يتم اختبارها جيدا، أقل أهمية. على سبيل المثال، يوصي المصنعون هيبسك-سم طلاء الخلية-ثقافة لوحات قبل البذر في الخلايا، ولكن في هذا التحليل محددة، طلاء لم يستخدم، لأن الخلايا التقيد تماما بسهولة على الأسطح المختلفة، ومن الصعب جداً صحيح معطف 384-جيدا لوحات. طلاء لوحة الخلية قد تكون لا تزال المسموح بها، أو بعد، حتى أنه يمكن تحسين نوعية المقايسة. نحن أيضا لم اختبار سواء المذيبات خلاف [دمس] يكون مقبولاً، ولكن المتوقع من التجربة مع تقنيات أخرى لتسجيل كما أن تركيزات مماثلة EtOH أو ميوه مقبولة. ونحن عموما استخدام سم هيبسك من نفس الشركة المصنعة، وتم اختبار خلايا من المورد إضافية واحدة فقط، التي يبدو أن تعمل بطريقة مشابهة. وبالمثل، فقد استخدمنا سوى عدد قليل من مجموعات مختلفة من هيبسك-المهاجرة التي تم تحديدها قبل بريتشيكينج عليها للتحقق من أنها تصرفت على نحو مماثل إلى الدفعة الأولى. واعتبرت دفعات واحد أو اثنين غير مناسب لأنه كان على سينسيتيا الاستقرار الفقراء أو إمكانية تكرار نتائج تحت ظروف الثقافة المستخدمة هنا. خلاف ذلك، الصيدلة تبدو مشابهة جداً عبر دفعات عند اختبار فريق محدود من مركبات “نموذجية” (فورسكولين، N6-سيكلوبينتيل-الأدينوزين، و E-4031، فضلا عن endothelin، إيسوبروتيرينول، املوديبين، وبونيسيمود). فقط استخدمنا سم هيبسك المستمدة من المانحين صحي. قد يكون من المفيد تقييم ما إذا كان هيبسك-سم المستمدة من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب ستوفر نتائج مختلفة، على الرغم من أن لا فرق بين المانحين صحي والمرضى لوحظ عند تقييم كارديوتوكسيسيتي لمثبطات تيروزين كيناز 12-وأخيراً، علينا أن ننتظر 22-28 يوما في الثقافة قبل قياس آثار المخدرات عادة: تجربتنا مع تسجيلات مقاومة لنفس الخلايا، حالة من الثبات لبطء معاوقة (مؤشر لاستقرار طبقة الخلية) ومقاومة سريعة (مؤشر ل ضرب التردد) هو الذي تم التوصل إليه بعد 12–15 يوما في الثقافة. ومع ذلك، قررنا الانتظار 22–28 يوما، لأن هذا هو الوقت عندما استقر الشخصية التعبير من علامات النضج وقنوات القلب13. أنها لم تدرس ما إذا كانت سوف يمكن الحصول على نتائج قابلة للمقارنة إذا تم استخدام الخلايا في وقت سابق أو في وقت لاحق.
هنا يستخدم بروتوكول وصف واضحة جداً قياس معدل الضرب عفوية سم هيبسك لتقييم آثار المخدرات على البشرية القلب الكهربية. مميزاتها الرئيسية على منهجيات أخرى هي أن ط) أنها قابلة لبيئة فرز الفائق والثاني) فإنه يسجل نشاط cardiomyocytes وآثار المخدرات في درجات حرارة الفسيولوجية، والثالث) أنه لا يتطلب الخبرة الكهربية للتنفيذ أو لإجراء تقييم للنتائج.
في التحقق من صحة دراسة أجريت مع العديد من الأدوية المعتمدة للاستخدام البشري، واظهرنا أن الإنزيم يتفاعل مع الأدوية المستخدمة في الطب البشري كما هو متوقع ب البيانات السريرية الحالية5. لأن هذا الأسلوب يعتبر جميع الآثار المحتملة على إيقاع القلب، وهو يكمل شاملة في المختبر بروارهيثميك المقايسة (CiPA) مبادرة14 أن يقيم إمكانات برو-اضطرابات على وجه التحديد.
في المستقبل، يمكن أن يوفر هذا الأسلوب المزيد من فهم طريقة عمل المخدرات أظهرت أن تؤثر على معدل الضرب عفوية. ومن المرجح أن معلومات ميكانيكية إضافية موجودة في التسجيلات fluorescence العابرين Ca (مثلاً، في السعة أو الشكل). إذا كان يتم إجراء التسجيلات fluorescence معدلات اقتناء أعلى (مثلاً، 30 هرتز)، يتم استخراج هذه المعلمات بسهولة بالإضافة إلى ضرب معدل، وقد يكون من المهم ربط التغيرات في هذه المعلمات بالآثار المعروفة من وتستخدم سريرياً المخدرات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين قد لا إعلامات.
Materials
| FDSS7000 fluorescent plate reader | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
not a catalog item | |
| FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
installed initially in the device |
|
| FDSS7000 temperature control | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A10118-09 | |
| FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
C11653-11 | |
| FDSS7000 pipet tips for 384-well plates | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A8687-62 | |
| Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
U8524-12 | optional alternative to the Igor Pro software |
| Igor Pro data analysis software | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) |
Latest version | |
| iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | includes cells, plating and maintenance media |
| Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (Cologne, Germany) |
Ax-B-HC02-4M | includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes |
| 384-well cell culture plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
| 384-well compound plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
| FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) |
R8142 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
F6886 | |
| N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
C8031 | |
| E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) |
BML-KC158 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15250061 |
References
- Guo, L. Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).
- Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes. Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).
- Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).
- Ma, J. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sube, R., Ertel, E. A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs. Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).
- Sirenko, O. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).
- VanderPlas, J. T. Understanding the Lomb-Scargle Periodogram. Cornell Univeristy Library. , (2017).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).
- Sanguinetti, M. C. Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs. Hypertension. 19, 228-236 (1992).
- Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels. Marine Drugs. 15 (10), (2017).
- Sharma, A. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Puppala, D. Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell–derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue. Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).
