384-şey plakaları ısı kontrollü bir Ca duyarlı floresan boya ile ölçülen insan IPSC türetilmiş Cardiomyocyte Syncytia kasılmalar

1. hücre plakaları hazırlanması Not: hücre plakaları 3-4 hafta önce uyuşturucu etkileri ölçümü hazırlayın. Denemenin 0 günNot: planlama amacıyla, sınama bileşik uygulaması herhangi bir gün gün 22-28 deneme arasında gerçekleştirilebilir. Su banyosu 37 ° C’de açmak ve (üretici tarafından sağlanan gibi) kaplama orta 40 mL sıcak.Not: hücreleri onların tedarikçi tarafından sağlanan eşleşen kültür ve bakım kitle iletişim araçları ile kullanın. HiPSC-CM su banyosu 2 min için dondurulmuş hücreleri içeren cryotubes koyarak çözülme. 1 mL hücre süspansiyonlar dikkatle 50 mL konik tüp aktarın. Her cryotube arta kalan hücreleri almak ve yıkama medya aynı konik tüp için adım 1.1.3 içeren hücrelerden eklemek için sıcak kaplama orta 1 mL ile yıkayın. Dikkatli bir şekilde başka bir 8 mL sıcak kaplama Orta hücre süspansiyon karıştırın. Trypan mavi dışlama yöntemi ve hematocytometer8kullanarak canlı hücreleri saymak.Not: 6 x 106 şartı hücreleri için bir 384-şey hücre plaka deneyimlerimize maksimum olduğu ölü hücreleri donmuş hücreleri arasında olasılığını dikkate alır. Hücre süspansiyon 5 x 105 canlı hücre/ml sıcak kaplama orta ile ayarlayın. Hücre süspansiyon için her şey (iyi başına yaklaşık 12.500 hücreleri) 25 µL ekleyerek iki 384-şey hücre kalıplara dağıtın.Not: Hücre plakaları ile herhangi bir matris precoated gerekmez ( konuyabakın). 37 ° c oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren hücre plakaları korumak. Gün 1 deneme 37 ° C ve bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm ile desteklenmiş 50 mL sıcak su banyosu açın. 50 µL sıcak bakım orta her iyi hücre plakaların kaplama orta yerine. Gün 2-(en çok gün 27) 21 denemeNot: sigara bölen olduğu gibi herhangi bir bu süre içinde passaging hiPSC-CMs gerekmez hücreleri. Bakım orta yarısı 3 gün her 2-yenilemek ve tamamen, 7, 14 ve 21 günlerde yenilemek.Not: 22 ve deneme 28 gün arasında floresans ölçüm gerçekleştirilir. Daha uzun süreler hiç denemedim ama hala iyi olabilirsin. 2. araç, bileşik plakaları ve tahlil plakaları hazırlanması Not: hazırlamak enstrüman, bileşik plakaları ve tahlil plakaları uyuşturucu etkileri, 22-28 deneme gün arasında ölçüm günü. Sıcaklık kontrolü ve uygun floresan filtre seti ve uyarma ışık ile donatılmış bir floresan plaka okuyucu kullanın kaynak. Örneğin, bir Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 floresan filtre seti kullanın (uyarma: 472 nm; Emisyon: 520-560 nm) ve 150 W uyarma ışık kaynağı birimi. İlk hücre plaka ölçüm için plaka okuyucu içinde yerleştirilmesi için önce en az 2 h okuyucu üzerinde açın ve Isıtma sistemi 37 ° C’de ayarlayınNot: Bu akşam önce yapılabilir. Pozitif denetimleri, forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031 hisse senedi çözümleri DMSO, DMSO 10 mM ve 3.33 mM H2O, 0,33 mm olarak anılan sıraya göre hazırlayın.Not: stok çözümleri 333-fold seyreltilmiş zamanla bunlar hücrelere eklenir ve amaç 1 µM forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-Adenozin ve 10 µM son test konsantrasyonları elde etmektir güvenilir ve tekrarlanabilir efektler oluşturmak E-4031. 352 test bileşikler olarak DMSO hisse senedi çözümleri 333-fold planlanan test konsantrasyonları (Örneğin, bir test 30 µM için 10 mM), hazır olun.Not: Amaç %0,3 (v/v) DMSO hücre plaka son bir konsantrasyon bileşik uygulamadan sonra elde etmektir; cardiomyocytes ritmik etkinliği etkilemez en DMSO yoğun bu. Hisse senedi çözümleri de önceki gün hazır olun. En az 5 µL hisse senedi çözüm yinelenen her ölçüm için gereklidir. Bileşik plakaları hazırlayın. Bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm Oda sıcaklığı ile takıma 40 mL sıcak. Hisse senedi çözüm iyi başına 1,5 µL ekleyerek iki 384-şey bileşik kalıplara dağıtmak: i) test bileşikler (iki kuyu her), pozitif II) denetimleri (forskolin, N6-cyclopentyl-Adenozin ve E-4031, dört kuyu her bileşik plaka başına) ve III) negatif Denetim (DMSO, bileşik plaka başına 20 kuyu). 100 x g 1 dk. için de bileşik plakaları santrifüj kapasitesi. Bakım orta 37 µL her şey (Bu aşamada 38,5 µL % 3,9 DMSO) Oda sıcaklığında ekleyin. 100 x g 1 dk. için de bileşik plakaları santrifüj kapasitesi. Bileşik plakaları plaka okuyucu yükleyin.Not: Sonraki adımlar en kısa zamanda bileşik plakaları buharlaşma en aza indirmek için yapılmalıdır. Floresan boya hazırlamak. 37 ° C ve bakım orta % 1 v/v penisilin-streptomisin çözüm ile desteklenmiş sıcak 100 mL su banyosu açın. Ca-duyarlı floresan boya ve içki 10 mL sıcak bakım orta antibiyotik ile yeniden oluşturma.Not: Bu hisse senedi floresans orta Ca duyarlı floresan boya, genellikle Fluo-4 ve bir içki içerir ve herhangi bir artık 4 ° C’de en az 5 gün süreyle saklanabilir. 3. veri toplama Not: veri toplama uyuşturucu etkileri ölçüm günü gerçekleştirmek. Adımları izleyerek 3.1-.10 tamamen için ilk hücre plaka, sonra onları ikinci hücre plaka için yineleyin. Plaka okuyucu bilgisayar yazılımı (gerekirse) başlatın ve damlalıklı ipuçları yüklemek. Kalsiyum dalgalar 2 dk segmentinin en az 10 Hertz temel Dayak oranı her şey için tanımlamak için bir satın alma sıklığı ile kaydetmek için yazılım ayarları. Bir hücre plaka için hisse senedi floresans orta 3 mL 12 mL sıcak bakım orta floresan orta yapmak için antibiyotik içine oranında seyreltin. Her iyi hücre plaka orta 20 µL floresans orta 30 µL ile değiştirin. Yukarı ve aşağı 1 x-karıştırmak için pipet. Hücre plaka plaka okuyucu için sıcaklık parkenizin hiPSC CM izin için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde yerleştirin. 60 dakika için veri toplama başlamadan önce bekleyin. Veri toplama Ca dalgalar 2 dk segmentinin en az 10 Hz oranı her şey için dayak temel tanımlamak, bir satın alma sıklığı ile kaydetmek için plaka okuyucu yazılım başlatın.Not: her kayıt dizisi için hücre plaka değil transfer otomatik olarak cihazın dışında veri toplama sonra emin olun. Bu hücre plaka oda sıcaklığında soğutma engeller. Plaka okuyucu yazılım bazı sürümleri ile bunu başarmak için tamamen bitmeden her kaydı durdurmak gerekli olabilir. İyi-iyi 5 µL bileşik plaka hücre plaka pipetting tarafından test ve referans bileşikleri plaka okuyucu robot ile eklemek (eklenmesinden sonra DMSO konsantrasyon %0,3 [v/v] ‘s). Veri toplama plaka okuyucu yazılım kayıt 2 dk kesimine 5, 15, 30, 45 ve 60 dk hakkında bileşik toplama sonra başlayan Ca dalgaların başlatmak (hücre levha kalıyor her zaman cihazý emin olun). 4. veri analizi Not: veri analizi herhangi bir süre sonra ölçüm yapılabilir. Ham veri–dan plaka okuyucu bilgisayar yazılımı her kayıt döneminde ASCII metin dosyaları olarak dışa aktarın. Veri analiz yazılımı ham veri. Her şey ve bütün zaman puan için birincil dayak frekans ayıklayın.Not: Tablo reçetesilistelenen veri analiz yazılımı ile frekansları yenerek en küçük kareler spektral analiz7 Lomb – Scargle yöntemiyle alan LombPeriodogram işlevini kullanarak bir özel analiz rutin ile hesaplanabilir . Periodogram frekansları 0,01 ve 5 Hz arasında bir dizi için hesaplanmalıdır. Birincil frekans PeakAutoFind rutinleri kullanılarak periodogram elde edilebilir. Bu analiz yöntemi Frekanslar plaka okuyucu yazılımı ile isteğe bağlı olarak sağlanan yöntem daha yenerek daha doğru ölçümler sağlar. Yazılım özelleştirme bir seçenek değilse ancak, ikincisi hala kullanılabilir. Birincil dayak frekanslar için veri analiz yazılımı her kayıt döneminden panoya kopyalar veya ASCII metin dosyaları olarak dışa aktarın. Birincil dayak Frekanslar Pano yapıştırma veya metin dosyası alma tarafından bir elektronik tablo yazılımı alın.Not: adımları 4.5-4.9 herhangi bir modern elektronik tablo yazılımda gerçekleştirilebilir. Her şey için satır taban çizgisine dayak frekans, her zaman bir noktada ilaç uygulama sonra normale (5, 15, 30, 45 ve 60 dk) o zaman birincil dayak frekans bölünmesi ile temel birincil dayak frekansta ölçütü üzerine gelin. İlaç uygulama sonra her zaman bir noktada ortalama DMSO etkisini hesaplayın (5, 15, 30, 45 ve 60 dk) nerede DMSO uygulandığı 20 kuyuları için normalleştirilmiş değerlerin ortalamasını tarafından. Her şey ve her zaman uyuşturucu uygulamadan sonra gelin için (5, 15, 30, 45 ve 60 dk), çıkarma (zaman uyumlu) ortalama DMSO etkisi aynı plaka için. Yinelenen ölçümler ortalama.Not: bileşik aritmiler üretilen olup olmadığını bir bileşik sıklığını değiştirir veya yazılım birincil bir frekans bileşik toplama sonra bulamamanız durumunda, dayak deseninin görsel muayene değerlendirebilir.