התכווצויות של האדם iPSC-נגזר Cardiomyocyte Syncytia נמדד עם תיוג הפלורסנט Ca הרגישים ב טמפרטורה מבוקרת צלחות 384-ובכן

1. הכנת לוחות תא הערה: הכינו את הצלחות תא 3–4 שבועות לפני המדידה של השפעות סמים. יום 0 של הניסויהערה: למטרות תכנון, היישום מורכבות הבדיקה יכולה להתבצע בכל יום בין ימים 22–28 של הניסוי. להפעיל את המים הרותחים ב 37 מעלות צלזיוס, לחמם 40 מ של ציפוי בינוני (כפי שסופק על-ידי היצרן).הערה: השתמש בתאים עם שסופק על-ידי הספק תואמים ותחזוקה של תרבות התקשורת שלהם. להפשיר את hiPSC-ס מ על-ידי הצבת את cryotubes המכיל תאים קפוא באמבט מים למשך 2 דקות. העבר את המתלים תא 1 מ”ל בקפידה צינור חרוטי 50 מ. לשטוף כל cryotube עם 1 מ”ל של ציפוי חמה בינוני כדי לאחזר את שאריות תאי ולהוסיף התקשורת שטיפת הצינור חרוט באותה מתאי המכיל שלב 1.1.3. מערבבים בזהירות אחר 8 מ ל בינוני ציפוי חמים לתוך התליה תא. לספור תאים חיים באמצעות השיטה הדרה trypan blue ו- hematocytometer8.הערה: לדרישה של 6 x 106 תאים עבור לוח אחד של התא 384-ובכן שוקלת את האפשרות של עד 20% תאים מתים בין תאי קפוא, זה מקסימום מניסיוננו. להתאים את התליה תא 5 x 105 בשידור חי תאים/מ עם המדיום ציפוי חמים. להפיץ התליה תא לתוך שתי צלחות תא 384-טוב על-ידי הוספת 25 µL מכל קידוח (כ 12,500 תאים לכל טוב).הערה: הלוחות תא לא צריך להיות precoated עם כל מטריצה (ראה דיון). לשמור על הלוחות תא ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2. יום 1 של הניסוי הפעל את המים הרותחים 37 ° C, חמים 50 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v. החלף את המדיום ציפוי µL 50 של תחזוקה חמים במדיום כל טוב של הלוחות התא. ימים 2–21 (עד יום 27) של הניסויהערה: hiPSC-CMs לא צריך שום passaging במשך תקופה זו, כפי שהן ללא חלוקת תאים. לחדש חצי של המדיום תחזוקה כל 2–3 ימים, לחדש אותו לחלוטין על ימים 7, 14, ו- 21.הערה: ניתן לבצע מדידת קרינה פלואורסצנטית בין ימים 22 ו- 28 של הניסוי. משכי זמן ארוכים יותר לא נוסו אך עדיין עשויים להיות בסדר. 2. הכנה של כלי נגינה, מתחם לוחות Assay צלחות הערה: להכין את כלי הנגינה, מתחם לוחות, ואת וזמינותו צלחות ביום של המדד של השפעות סמים, בין ימים 22 ו- 28 של הניסוי. להשתמש בקורא צלחת פלורסנט מצויד עם בקרת טמפרטורה ואור של זריחה המתאים המסנן קיט ו עירור מקור. לדוגמה, השתמש ערכת מסנן קרינה פלואורסצנטית Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (עירור: 472 ננומטר; פליטה: 520–560 ננומטר) ו- 150 W עירור מקור אור יחידה. לפחות שעתיים לפני הלוח התא הראשון יש למקם בתוך לקורא צלחת על המדידה, להפעיל את הקורא ולהגדיר מערכת החימום ב 37 º C.הערה: גם ניתן לבצע זאת ערב קודם. הכינו את הפקדים חיובית forskolin, N6-cyclopentyl-אדנוזין, E-4031 כפתרונות מניות של 0.33 מ מ דימתיל סולפוקסיד, 10 מ מ דימתיל סולפוקסיד ולאחר 3.33 מ מ ב- H2O, בהתאמה.הערה: מלאי פתרונות להיות מדולל 333-fold בזמן הוספתן על התאים, ואת המטרה היא להשיג ריכוזי המבחן האחרון 1 מיקרומטר forskolin, 30 מיקרומטר N6-cyclopentyl-אדנוזין, ו- 10 מיקרומטר E-4031, אשר מייצרים תופעות אמין לשחזור. הכנת תרכובות מבחן 352 כפתרונות מניות דימתיל סולפוקסיד בריכוזים 333-fold המבחן המתוכנן (למשל, 10 מ מ עבור מבחן 30 מיקרומטר).הערה: המטרה היא להשיג ריכוז סופי של 0.3% (v/v) דימתיל סולפוקסיד בצלחת תא לאחר היישום מורכב; זהו הריכוז הגבוה ביותר דימתיל סולפוקסיד שאינה משפיעה על פעילות אומנותית cardiomyocytes. הפתרונות מניות ניתן גם להכין יום לפני. מינימום של 5 µL של פתרון מניות נדרשת עבור כל אחת מהמידות כפולים. הכינו את הצלחות במתחם. חמים 40 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v לטמפרטורת החדר. להפיץ לתוך שתי צלחות 384-ובכן מורכבים על-ידי הוספת µL 1.5 של מניות פתרון לכל טוב: i) תרכובות מבחן (שתי בארות כל), ii) את הפקדים חיובי (forskolin N6-cyclopentyl-אדנוזין, E-4031, מארבע בארות כל לכל צלחת מתחם) ו- iii) שלילי שליטה (דימתיל סולפוקסיד, בארות 20 לכל צלחת מורכב). Centrifuge הלוחות מורכבים ב x 100 g עבור 1 דקות. להוסיף µL 37 תחזוקה בינוני בטמפרטורת החדר מכל קידוח (3.9% דימתיל סולפוקסיד ב- 38.5 µL בשלב הזה). Centrifuge הלוחות מורכבים ב x 100 g עבור 1 דקות. לטעון את הצלחות מתחם לקורא צלחת.הערה: השלבים הבאים צריכה להתבצע בהקדם האפשרי כדי למזער את אידוי לוחית מורכבים. הכינו את הפלורסנט. הפעל את המים הרותחים 37 ° C, חם 100 מ של תחזוקה בינוני בתוספת 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין v/v. לשקם את הפלורסנט Ca רגיש ואת כ’חטיף עם 10 מ”ל של תחזוקה חמה בינוני עם אנטיביוטיקה.הערה: בינוני פלורסצנטיות מניות מכילה הפלורסנט של Ca-רגיש, בדרך כלל Fluo-4 וכ’חטיף, ניתן לאחסן כל שארית ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים לפחות. 3. חדרי קירור והקפאה הערה: לבצע רכישת נתונים ביום של המדד של השפעות סמים. לבצע צעדים 3.1–.10 לחלוטין עבור הלוח התא הראשון, ולאחר מכן חזור על אותם עבור הלוח התא השני. הפעל את תוכנת קורא צלחת (במידת הצורך) ולטעון את העצות pipet. התאם את הגדרות התוכנה להקליט קטע 2 דקות של סידן גלי עם תדירות רכישה לפחות 10 הרץ כדי להגדיר את קצב המכות בסיסית עבור כל טוב. לצלחת תא אחד, לדלל 3 מ”ל של זריחה מניות בינוני לתוך 12 מ של תחזוקה חמה בינוני עם אנטיביוטיקה כדי להפוך המדיום זריחה. החלף µL 20 בינוני היטב כל צלחת תא µL 30 פלורסצנטיות בינוני. פיפטה למעלה ולמטה x 1 לערבב. מקם את הצלחת תא לקורא צלחת מהר ככל האפשר לתת להתאקלם הטמפרטורה של hiPSC-ס מ. המתן עד 60 דקות לפני התחלת רכישת נתונים. התחל רכישת נתונים בתוכנת reader צלחת להקליט קטע 2 דקות של Ca גלים עם תדירות רכישה לפחות 10 הרץ, כדי להגדיר את התוכנית הבסיסית פועם בקצב במשך כל.הערה: עבור כל רצף הקלטה, לוודא הצלחת תא לא מועברים באופן אוטומטי מתוך המכשיר לאחר הרכישה נתונים. פעולה זו מונעת את הצלחת תא קירור בטמפרטורת החדר. עם גירסאות מסוימות של תוכנת קורא צלחת, ייתכן צורך לעצור את כל הקלטת לפני שהיא נגמרת לגמרי כדי להשיג זאת. להוסיף את תרכובות בדיקה ועיון עם הרובוט קורא צלחת על-ידי pipetting µL לובכן 5 מהצלחת המורכב המשקולת תא (לאחר תוספת, ריכוז דימתיל סולפוקסיד הוא 0.3% [וי/v]). להתחיל רכישת נתונים בתוכנת reader צלחת כדי להקליט 2 דקות מקטעים של Ca גלי החל על 5, 15, 30, 45 ו- 60 דקות לאחר הוספת תרכובת (הקפד בכל פעם הצלחת תא נשאר במכשיר). 4. ניתוח נתונים הערה: ניתוח הנתונים יכול להתבצע בכל עת לאחר המדידה. ייצוא הנתונים הגולמיים עבור כל תקופת הקלטה בתוכנת reader צלחת כמו קבצי טקסט מסוג ASCII. לייבא את הנתונים הגולמיים לתוך התוכנה ניתוח נתונים. כל טוב, כל הזמן נקודות, לחלץ מכות הראשית בתדירות.הערה: עם התוכנה ניתוח הנתונים המופיעים בטבלה של חומרים, להכות התדרים ניתן לחשב עם תרגיל ניתוח מותאם אישית באמצעות הפונקציה LombPeriodogram, המבוסס על שיטת לומב – Scargle של ניתוח ספקטרלי ריבועים7 . יש לחשב את periodogram עבור טווח התדרים בין 0.01 ל- 5 הרץ. התדר הראשי יכול להיות מופק את periodogram באמצעות את רוטינות PeakAutoFind. שיטה זו ניתוח מספקת מדידות מדויקות יותר של פועם תדרים מאשר השיטה שסופק כאפשרות עם התוכנה קורא צלחת. עם זאת, האחרון עדיין יכולים לשמש אם התאמה אישית תוכנה זו לא אופציה. ייצוא התדרים מכות העיקרי עבור כל תקופת ההקלטה מתוך התוכנה ניתוח נתונים כמו עותקים הלוח או קבצי טקסט מסוג ASCII. לייבא התדרים הראשי מכות בתכנת על-ידי הדבקה מהלוח או ייבוא קובץ טקסט.הערה: ניתן לבצע צעדים 4.5–4.9 שבכל תוכנה מודרני של גיליון אלקטרוני. עבור כל טוב, לנרמל בסיסית התדר מכות בכל נקודה בזמן לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות) על-ידי חלוקת התדר מכות העיקרי באותו הזמן הצבע לפי תדירות מכות הראשי בנקודת ההתחלה. לחשב את ההשפעה דימתיל סולפוקסיד רעה בכל נקודה בזמן לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות) על-ידי חישוב ממוצע ערכי מנורמל בשביל הבארות 20 שבו הוחלה דימתיל סולפוקסיד. עבור כל טוב, בכל פעם הצבע לאחר היישום סמים (5, 15, 30, 45, 60 דקות), לחסר רשע דימתיל סולפוקסיד אפקט (תואם זמן) באותה הצלחת. ממוצע המדידות כפולים.הערה: אם תרכובת משתנה תדירות או התוכנה לא מוצאת תדר הראשי לאחר התוספת מורכבים, בדיקה ויזואלית של התבנית פועם ניתן להעריך אם המתחם המיוצר הפרעות בקצב הלב.