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Medicine

Kontraktionen der iPSC abgeleitete Cardiomyocyte Syncytia gemessen mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff in temperaturgesteuerten 384-Well-Platten

Published: October 18, 2018
doi:
10.3791/58290
, ,
1Department of Pharmacology and Preclinical Development,Idorsia Pharmaceuticals Ltd

Summary

Spontan contracting Syncytia von Kardiomyozyten abgeleitet von Human-induzierte pluripotente sind Stammzellen nützliche Modelle der menschlichen Herz Physiologie und Pharmakologie. Hier präsentieren wir ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Quantifizierung der Auswirkungen von exogenen Verbindungen auf Frequenz zu schlagen, mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und temperaturgeführte imaging Multi-well-Platte Leser.

Abstract

Spontan contracting Syncytia von Kardiomyozyten abgeleitet von Human-induzierte pluripotente sind Stammzellen (HiPSC CM) ein sinnvolles Modell der menschlichen Herz Physiologie und Pharmakologie. Verschiedene Methoden sind vorgeschlagen worden, um diese spontane Aktivität aufzuzeichnen und um Drogenwirkungen zu bewerten, aber viele dieser Methoden begrenzter Durchsatz und/oder physiologische Relevanz leiden. Wir entwickelten ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Quantifizierung der Auswirkungen von exogenen Verbindungen auf HiPSC-CM Prügel Frequenz mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und temperaturgeführte imaging Multi-well-Platte Leser. Wir beschreiben, wie Sie die Zelle und die zusammengesetzten Platten vorbereiten und Ausführen von automatisierten Tests um hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit zu erreichen. Wir beschreiben auch, wie zu transformieren und analysieren die Fluoreszenz-Daten, um zuverlässige Maßnahmen der Drogenwirkungen auf spontane Rhythmus zu bieten. Dieser Assay kann in Drug Discovery-Programme verwendet werden, um chemische Optimierung Weg, oder in Richtung, Verbindungen beeinflussen menschliche Herzfunktion führen.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der Wirkungen der Droge auf die spontane schlagen Häufigkeit von Syncytia HiPSC-cm bei physiologisch relevanten Rhythmen. Human-induzierte pluripotente Stammzellen können in funktionellen Herzmuskelzellen unterscheiden, die spontan schlagen Syncytia in-vitro-1,2,3,4zu etablieren. Diese HiPSC-CM erhalten Sie in großer Zahl durch kommerzielle Anbieter oder durch Produktion im Labor, und sie sind eine nützliche Quelle für Zellen, Modelle der menschlichen Herz Physiologie und Pharmakologie zu generieren. Insbesondere dienen sie vorherzusagen oder kardiale Auswirkungen zu charakterisieren, die auftreten können, wenn ein Medikament für Menschen5verabreicht wird.

Die Tracht Prügel Frequenz von HiPSC CM Syncytia unter physiologischen Bedingungen mit Mikroelektrode Arrays oder Impedanz sensing1gemessen werden: diese nicht-invasive Techniken sehr detailliert Aufschluß über Drogenwirkungen, sondern sie sind vielmehr niedrig-Durchsatz und sie erlauben Tests große zusammengesetzte Bibliotheken innerhalb der realistischen Zeit- und Budgetrestriktionen nicht. Ein effektiveres System kann mit einem 384-Well-Fluoreszenz imaging-Platte Leser ausgearbeitet werden und ein Ca-sensibler Farbstoff6, aber klassische Platte Leser werden behindert durch suboptimale Temperatur Kontrolle und Übernahme-Frequenz. Diese Einschränkungen werden durch unphysiologisch schlagenden Preise (~ 15 Bpm, im Vergleich zu 35 – 55 Bpm in kontrollierten Umgebungen1) dargestellt und schlechte Ca Signal Auflösung (eine Übernahme-Frequenz von 8 Hz ist an der unteren Grenze in Rekordgeschwindigkeit, die 120 Bpm erreichen können stimulierten Bedingungen und es kann nicht extrahiert werden Informationen wie Hang oder Dauer). Die hier beschriebene Methode kombiniert die Aufnahme Muster zu schlagen, physiologische Rhythmen und ausreichender Auflösung um diese Bedenken entgegenstehen.

Auf der positiven Seite ist diese Methode einfach, zuverlässig und hohen Durchsatz, der ermöglicht die schnelle Prüfung einer großen Anzahl von Verbindungen zu vertretbaren Kosten. Auf der negativen Seite diese Methode erfordert einen schnelle Platte Leser mit effektiven Temperaturregelung, die eine teure Investition ist, und es gibt wenig mechanistischen Auskunft über beobachteten Drogenwirkungen, die erfordern möglicherweise weiteren Tests mit detaillierter Methoden.

Ca. 6 x 106 HiPSC CM werden benötigt für eine Messung in einem 384-Well Zellplatte. HiPSC-CM sind in der Regel kommerziell als gefrorene Aliquote von ~ 4 x 106 Zellen in 1 mL geliefert. Daher ist es praktisch zwei Zellplatten mit drei eingefrorenen aliquoten vorzubereiten. In den meisten Fällen aufgrund der geringen Variabilität des Assays, es ist ausreichend, um doppelte Messungen der Testverbindungen durchführen und in jeder Zelle Platte, vierfacher Messungen der Positivkontrolle (Forskolin, N6-Cyclopentyl-Adenosin und E-4031), und 20-notwendige Messungen der Negativkontrolle (DMSO allein). Daher kann maximal 352 Verbindung/Konzentration Paare mit zwei 384-Well Zellplatten ausgewertet werden. Das folgende Protokoll hält ein solches Experiment durchgeführt mit 352 Testverbindungen, zwei Zellplatten und 12 Millionen Zellen, die als drei eingefrorenen aliquoten geliefert; Es kann leicht skaliert-Up sein, wenn zusätzliche Datenpunkte erforderlich sind.

Protocol

1. Vorbereitung des Zellplatten Hinweis: Bereiten Sie 4 Wochen vor der Messung von Drogenwirkungen Zellplatten 3–. Tag 0 des ExperimentsHinweis: für Planungszwecke, zusammengesetzte Testanwendung kann an jedem beliebigen Tag zwischen Tagen 22–28 des Experiments durchgeführt werden. Schalten Sie das Wasserbad bei 37 ° C und warm 40 mL Beschichtung Medium (wie vom Hersteller geliefert).Hinweis: Verwenden Sie die Zellen mit ihren Lieferanten zur Verfügung gestellten passende Kultur und Wartung Medien. Tauen Sie die HiPSC-CM indem man die Cryoröhrchen mit eingefrorenen Zellen im Wasserbad für 2 min auf. Übertragen Sie 1 mL-Zellsuspensionen sorgfältig auf eine 50 mL konische Rohr. Waschen Sie jeden Cryotube mit 1 mL warmen Beschichtung Medium abrufen die übrig gebliebenen Zellen und das gleiche konische Rohr aus Schritt 1.1.3 enthaltenden Zellen waschen Medien hinzufügen. Mischen Sie sorgfältig ein weiteres 8 mL warmen Beschichtung Medium in der Zellsuspension. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan blau-Ausschluss-Methode und eine Hematocytometer8.Hinweis: die Anforderung von 6 x 106 Zellen für eine 384-Well-Zelle Platte die Möglichkeit, bis zu 20 % toten Zellen unter der gefrorenen Zellen hält, ist ein Höchstmaß an unserer Erfahrung. Passen Sie die Zellsuspension auf 5 x 105 live Zellen/mL mit dem warmen Beschichtung Medium. Verteilen Sie die Zellsuspension in zwei 384-Well Zellplatten durch Zugabe von 25 µL in jede Vertiefung (ca. 12.500 Zellen pro Well).Hinweis: Die Zelle-Platten müssen nicht mit jeder Matrix vorbeschichteten werden (siehe Diskussion). Die Zelle-Platten bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2zu erhalten. Tag1 des Experiments Schalten Sie das Wasserbad bei 37 ° C und warm 50 mL Wartung Medium mit 1 % V/V Penicillin-Streptomycin Lösung ergänzt. Ersetzen Sie das Überzug Medium mit 50 µL Medium warm Wartung in jede Vertiefung der Zelle Platten. Tage 2–21 (bis 27. Tag) des ExperimentsHinweis: HiPSC-CMs brauchen keine passagierung in diesem Zeitraum sind nicht teilenden Zellen. Erneuern Sie die Hälfte des Mediums Wartung alle 2–3 Tage und ganz auf 7, 14 und 21 Tage erneuern.Hinweis: Die Fluoreszenzmessung kann zwischen 22 und 28 des Experiments Tag durchgeführt werden. Längere Laufzeiten haben nicht versucht, aber können immer noch in Ordnung sein. 2. Vorbereitung des Instruments, zusammengesetzte Platten und Assay-Platten Hinweis: bereiten Sie das Instrument, zusammengesetzte Platten und assay Platten am Tag der Messung von Wirkungen der Droge zwischen 22 und 28 des Experiments Tag. Benutzen Sie einen fluoreszierenden Platte Reader ausgestattet mit Temperaturregelung und eine entsprechende Filter Kit und Erregung Fluoreszenzlicht Quelle. Z. B. eine Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8-Fluoreszenz-Filter-Kit (Anregung: 472 nm, Emission: 520–560 nm) und ein 150 W Erregung Lichtquelleneinheit. Mindestens 2 h vor der ersten Zelle Platte ist innerhalb der Platte-Leser für die Messung platziert werden dem Leser aktivieren und festlegen die Heizungsanlage bei 37 ° C.Hinweis: Dies kann auch am Vortag erfolgen. Bereiten Sie die Positivkontrollen, Forskolin, N6-Cyclopentyl-Adenosin und E-4031 als Stammlösungen von 0,33 mM in DMSO, 10 mM in DMSO und 3,33 mM H2O, beziehungsweise.Hinweis: Lager-Lösungen werden 333-fold verdünnt werden mit der Zeit werden die Zellen hinzugefügt, und zielt darauf ab, Abschlusstest-Konzentrationen von 1 µM Forskolin, 30 µM N6-Cyclopentyl-Adenosin und 10 µM zu erreichen E-4031, die zuverlässige und reproduzierbare Effekte zu produzieren. Bereiten Sie die 352 Testverbindungen als DMSO Stammlösungen in 333-fold den geplanten Testkonzentrationen (z.B.10 mM für einen Test auf 30 µM).Hinweis: Ziel ist es, eine Endkonzentration von 0,3 % (V/V) DMSO in der Zellplatte nach der zusammengesetzten Anwendung zu erreichen; Dies ist die höchste DMSO-Konzentration, die nicht die rhythmische Aktivität der Herzmuskelzellen auswirkt. Die Stammlösungen können auch am Vortag zubereitet werden. Ein Minimum von 5 µL der Stammlösung ist für jede doppelte Messung erforderlich. Bereiten Sie die zusammengesetzten Platten. Erwärmen Sie 40 mL Wartung Medium ergänzt mit 1 % V/V Penicillin-Streptomycin Lösung auf Raumtemperatur. Durch Zugabe von 1,5 µL der Stammlösung pro Bohrloch in zwei zusammengesetzten 384-Well-Platten verteilen: i) Testverbindungen (zwei Brunnen), (Ii) die Positivkontrollen (Forskolin, N6-Cyclopentyl-Adenosin und E-4031, vier Brunnen pro zusammengesetzte Platte) und (Iii) die negativen Kontrolle (DMSO, 20 Brunnen pro zusammengesetzte Platte). Zentrifugieren Sie die zusammengesetzte Platten 100 X g für 1 min. Fügen Sie 37 µL Wartung Medium bei Raumtemperatur, in jede Vertiefung (3,9 % DMSO in 38,5 µL in diesem Stadium). Zentrifugieren Sie die zusammengesetzte Platten 100 X g für 1 min. Laden Sie die zusammengesetzten Platten in der Platte-Leser.Hinweis: Die nächsten Schritte sollte so bald wie möglich durchgeführt werden, um Verdunstung in den zusammengesetzten Platten zu minimieren. Vorbereiten der Fluoreszenzfarbstoff. Schalten Sie das Wasserbad bei 37 ° C und warm 100 mL Wartung Medium mit 1 % V/V Penicillin-Streptomycin Lösung ergänzt. Bereiten Sie die Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und Durstlöscher mit 10 mL warmen Wartung Medium mit Antibiotika.Hinweis: dieses Lager Fluoreszenz-Medium enthält die Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, in der Regel Fluo-4 und ein Durstlöscher und gebliebene kann für mindestens 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. 3. Datenerfassung Hinweis: führen Sie die Datenerfassung am Tag der Messung von Arzneimittelwirkungen. Führen Sie die Schritte 3.1–.10 ausschließlich für die erste Zelle Platte, dann wiederholen sie für die zweite Zelle Platte. Starten der Platte-Reader-Software (falls erforderlich) und laden Sie die pipettieren Tipps. Einstellungen Sie die Software-aufzeichnen ein 2 min-Segment der Kalzium-Wellen mit einer Übernahme-Frequenz von mindestens 10 Hertz, den Grundlinie schlagenden Preis für jedes gut zu definieren. Verdünnen Sie für eine Zellplatte 3 mL Lager Fluoreszenz Medium in 12 mL warmen Wartung Medium mit Antibiotika, die Fluoreszenz-Medium zu machen. 20 µL Medium in jede Vertiefung der Zellplatte mit 30 µL Fluoreszenz Medium zu ersetzen. Pipette nach oben und unten 1 X mischen. Legen Sie Zellplatte in der Platte Leser so schnell wie möglich, die HiPSC-CM auf die Temperatur akklimatisieren zu lassen. Warten Sie 60 Minuten vor Beginn der Datenerfassung. Starten Sie die Datenerfassung in die Platte-Reader-Software aufnehmen ein Segment 2 min Ca Wellen mit einer Übernahme-Frequenz von mindestens 10 Hz, Festlegung die Baseline-Rate für jedes gut schlagen.Hinweis: für jede Aufnahme-Sequenz, stellen Sie sicher der Zellplatte ist nicht automatisch übertragen aus dem Gerät nach der Datenerfassung. Dadurch wird verhindert, dass der Zellplatte bei Raumtemperatur abkühlen. Mit einigen Versionen von Platte-Reader-Software ist es möglicherweise notwendig, jede Aufnahme vor es komplett endet, um dies zu erreichen. Hinzufügen die Prüf- und Verbindungen mit der Platte Leser Roboter pipettieren von Brunnen zu Brunnen 5 µL aus der zusammengesetzten Platte in der Zellplatte (DMSO-Konzentration ist nach Zugabe, 0,3 % [V/V]). Starten Sie die Datenerfassung in die Platte-Reader-Software auf Rekord 2 min Segmente Ca Wellen über 5, 15, 30, 45 und 60 Minuten nach der zusammengesetzten Zugabe ab (stellen Sie sicher jedes Mal, der Zellplatte bleibt im Gerät). (4) Datenanalyse Hinweis: die Daten-Analyse kann jederzeit nach der Messung durchgeführt werden. Exportieren Sie die raw-Daten für jede Aufnahme-Periode aus der Platte-Reader-Software als ASCII-Text-Dateien. Importieren Sie die Rohdaten in der Datenanalyse-Software. Extrahieren Sie für jedes gut und allen Zeitpunkten die primäre schlagen Frequenz.Hinweis: Mit der Daten-Analyse-Software in der Tabelle der Materialienaufgeführt, kann Frequenzen zu schlagen mit einem benutzerdefinierten Analyse-Routine mit der LombPeriodogram-Funktion, basierend auf der Lomb – Scargle Methode der kleinsten Quadrate Spektralanalyse7 berechnet werden . Das Periodogramm sollte für eine Reihe von Frequenzen zwischen 0,01 und 5 Hz berechnet werden. Das Periodogramm mit der PeakAutoFind-Routinen kann die primärfrequenz entnommen werden. Diese Analysemethode liefert genauere Messungen schlagen Frequenzen als die Methode als eine Option mit der Platte-Reader-Software geliefert. Jedoch können diese noch verwendet werden, wenn Software-Anpassung nicht möglich ist. Exportieren Sie die primäre pulsierende Frequenzen für jede Aufnahme-Periode aus der Datenanalyse-Software als Zwischenablage Kopien oder als ASCII-Textdateien. Importieren Sie die primäre pulsierende Frequenzen per Zwischenablage einfügen oder Text-Datei-Import in ein Tabellenkalkulationsprogramm.Hinweis: Schritte 4,5–4.9 können in jedem modernen Tabellenkalkulations-Software durchgeführt werden. Für jedes gut normalisieren Baseline die Tracht Prügel-Frequenz zu jedem Zeitpunkt nach der Droge-Anwendung (5, 15, 30, 45 und 60 min.) durch Division der primären schlagen Frequenz zu diesem Zeitpunkt zeigen, indem die primäre schlagen Frequenz bei Studienbeginn. Berechnen Sie die mittlere DMSO Wirkung zu jedem Zeitpunkt nach der Droge-Anwendung (5, 15, 30, 45 und 60 min.) durch Mittelung der normalisierten Werte für die 20 Brunnen wo DMSO angewendet wurde. Für jedes gut und jedes Mal nach dem Zulassungsantrag Punkt (5, 15, 30, 45 und 60 min.), subtrahieren Sie die mittlere DMSO Wirkung (Zeit-angepasst) für die gleiche Platte. Durchschnittlich die doppelten Messungen.Hinweis: Wenn eine Verbindung Frequenz ändert oder die Software keine primäre Frequenz nach der zusammengesetzten Zugabe finden, eine Sichtprüfung des Musters schlagen kann beurteilen, ob die Verbindung Arrhythmien produziert.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Aufnahme von Ca-Wellen bei Studienbeginn über ein 384-Well-Platte. In den meisten Fällen, alle Brunnen zeigen eine regelmäßige Schläge Rate mit wenig Variabilität über die Platte (meine ± SD = 40,1 ± 3,5 Bpm; Palette = 34 – 54 Bpm). Sehr selten (weniger als 1 von 10 Experimente), ein paar Brunnen (weniger als 5) haben Arrhythmie oder fehlender Rhythmus. In drei 384-Well-Platten haben wir auch versucht, Herzmuskelzellen eines anderen Anbieters (siehe Tabelle der Materialien) und sehr ähnliche Ausgangswerte für die spontane Prügel bezogen. Blocker kardiale Ionenkanäle betreffen den Rhythmus der Herzmuskelzellen in reproduzierbarer Weise5. Amlodipin, einen Blocker langsam Ca-Kanäle9beschleunigt den Rhythmus von mehr als 100 % in einer Konzentration-abhängigen Weise bis zu 1 µM (Abbildung 2A). Die Wirkung ist innerhalb der ersten 5 min gut entwickelt, aber es noch erhöht ca. 50 % innerhalb der nächsten 30 min. bevor es stabilisiert. Über 1 µM, Amlodipin Verhaftungen das schlagen (gestrichelte Linien), wie aus der Tatsache zu rechnen ist, dass Ca Radfahren ist entscheidend für die spontane Kontraktionen. Andere selektive Dihydropyridine Ca-Kanal-Blocker erzeugen sehr ähnliche Wirkungen. E-4031, ein Blocker für die schnelle verzögerten Gleichrichter K Kanäle10, verlangsamt den Rhythmus ca. 65–70 % in einer Konzentration-abhängigen Weise bis zu 10 µM (Abb. 2 b). Die Wirkung entwickelt sich innerhalb der ersten 5 min und es schwankt nicht innerhalb der nächsten 60 Minuten. Andere selektive Blocker entfallen Wirkungen ähnlich, obwohl die maximale Rückgang (z.B.35 für Cisapride–40 %, 70 % für E-4031 und 90-95 % für Dofetilide) variieren kann. Die Grundlage für diese Diskrepanz ist nicht bekannt. Tetrodotoxin, einen Blocker des schnellen Na Kanäle11, verlangsamt den Rhythmus etwa 15 % in gewissem Sinne Konzentration abhängig, bis zu 1–30 µM (Abbildung 2). Die Wirkung ist innerhalb der ersten 5 min gut entwickelt und es schwankt nicht viel innerhalb der nächsten 60 Minuten. Jedoch über 30 µM Verhaftungen Tetrodotoxin die Schläge innerhalb der ersten 5 min, während es es nach 30 min oben 1 µM Verhaftungen. Andere Na-Kanal-Blocker, wie z. B. Lidocain oder Mexiletin, produzieren ähnliche Wirkungen wie alles oder nichts. Bepridil, eine gemischte Blocker von kardialen Na, Ca und K-Kanäle9, wirkt auch ein alles oder nichts (Abb. 2D). Dies deutet darauf hin, dass in dieser Zubereitung, ein Block von Na-Kanälen die primäre Wirkung des Bepridil ist. Eine Beschleunigung durch Ca-Kanal-Block ist nicht zu sehen, und die weitere Progressive Verlangsamung durch entfallen Block erscheint maskiert durch den Na-Kanal-Effekt. Abbildung 1: Repräsentative Basislinie Ca “Wellenlinien” über ein 384-Well-Platte. (A) alle Brunnen über die Platte eine regelmäßige Schläge Rate mit wenig Variabilität zeigen. Dieses Bild wird direkt von der Platte-Reader-Software erfasst. Jede Spur ist 10 s Dauer. Die Fluoreszenzintensität ist willkürlich (relative leichte Einheiten abgeleitet von der Videokamera Graustufen). (B) diese Blow-up von einem 10 s Spur zeigt die geringe Geräuschentwicklung des Signals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Repräsentative Wirkung von kardialen Ion Kanal Blocker. Diese Tafeln zeigen Konzentration-Wirkungs-Kurven mit (A) die selektive Ca-Kanal-Blocker Amlodipin, (B) die selektive entfallen Blocker E-4031, (C) die selektive Na-Kanal-Blocker TTX, und (D) der nicht-selektiven Kanal Blocker Bepridil. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Zwei Aspekte sind meist entscheidend für die erfolgreiche Aufnahme von Frequenzen zu schlagen. Die erste ist, vorsichtig sein mit Zelle Beschichtung und Kultur. Insbesondere ist es wichtig zu versuchen, und vermeiden Kratzer auf der Zellschicht an der Unterseite der Brunnen beim Austausch des Mediums. Es ist akzeptabel, die Brunnen mit den Pipetten berühren, aber der gleiche Winkel sollte verwendet werden, jedes Mal, wodurch nur einen winzigen Kratzer in der Zellschicht und nicht zum Nachteil der Testleistung. Der zweite wichtige Aspekt reproduzierbare homogene Rhythmen zu erhalten ist es, gute Temperaturregelung bei 37 ° C über der Zellplatte für die Dauer der Messung zur Verfügung zu stellen. Wir konnten nicht erhalten diese Homogenität mit andere Geräte als die Platte Leser hier verwendet, aber es darf mit speziellen Modifikationen an der Regulation der Körpertemperatur möglich sein: es würde das Protokoll hier vorgestellten allgemein nutzbare jenseits einer einzigen Marke der Platte machen Reader. Um mit dem Gerät hier verwendete Temperaturstabilität für die Dauer des Experiments zu erreichen, war es notwendig, jede Aufnahme vor es endete; Andernfalls würde der Roboter die gemessenen Zellplatte auswerfen. Dieses technische Problem kann mit dem nächsten Release der Platte-Reader-Software verschwinden, aber es bleibt vorerst kritisch. Wenn eine Zellplatte versehentlich außerhalb der Platte Leser übertragen wird, muss es so schnell wie möglich wieder in geladen werden. Allerdings wird die Qualität des Experiments verschlechtern, da Temperaturschwankungen die Tracht Prügel Rate extrem schnell beeinflussen.

Einige weitere Aspekte, die nicht gründlich getestet wurden, können weniger wichtig sein. Zum Beispiel HiPSC-CM Hersteller empfehlen Zellkultur Lackplatten vor der Aussaat der Zellen, aber in diesem spezifischen Assay Beschichtung nicht verwendet wurde, weil die Zellen ganz leicht auf verschiedene Oberflächen haften, und es sehr schwierig, richtig Mantel 384-Well ist Platten. Doch Zellplatte Beschichtung kann noch zulässig sein, oder es kann sogar die Assay-Qualität verbessern. Wir haben auch nie getestet ob Lösungsmittel als DMSO akzeptabel wäre, aber es aus Erfahrung mit anderen Aufzeichnungstechnologien erwartet ist, dass ähnliche Konzentrationen von EtOH oder MeOH auch erträglich wäre. Wir verwenden in der Regel HiPSC-CMs vom gleichen Hersteller und Zellen nur eine zusätzliche Lieferanten wurden getestet, die in ähnlicher Weise zu funktionieren schien. Ebenso haben wir nur eine kleine Anzahl verschiedener Chargen HiPSC-CMs verwendet, die durch prechecking sie ausgewählt wurden, um sicherzustellen, dass sie ähnlich dem ersten Stapel verhielten sich. Ein oder zwei Chargen galten hier unangemessen, weil ihre Syncytia schlechte Stabilität oder Reproduzierbarkeit unter die Kulturbedingungen hatte verwendet. Ansonsten erschien die Pharmakologie in Chargen sehr ähnlich, wenn eine begrenzte Panel von “typischen” Verbindungen (Forskolin, N6-Cyclopentyl-Adenosin, und E-4031, sowie Endothelin, Isoproterenol, Amlodipin und Ponesimod) zu testen. Wir haben nur HiPSC-CM von gesunden Spendern abgeleitet. Es kann sich lohnen zu beurteilen, ob HiPSC-CM-abgeleitet von Patienten mit Herzerkrankungen unterschiedliche Ergebnisse liefern würde, obwohl kein Unterschied zwischen gesunden Spendern und Patienten beobachtet wurde, bei der Bewertung der Kardiotoxizität von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren 12. schließlich warten wir normalerweise 22 – 28 Tage in Kultur vor der Messung Drogenwirkungen: nach unserer Erfahrung mit Impedanz-Aufnahmen der gleichen Zellen langsam ein Fließgleichgewicht für Impedanz (Indikator Zelle Schicht Stabilität) und schnelle Impedanz (ein Indikator für schlagen Frequenz) wird nach 12–15 Tage in Kultur erreicht. Allerdings haben wir 22–28 Tage warten, denn dies ist die Zeit wann das Expressionsprofil kardiale Kanäle und Reifung Marker13stabilisiert hat. Es wurde nicht geprüft, ob vergleichbare Ergebnisse erzielt werden würde, wenn die Zellen früher oder später dienten.

Das Protokoll beschrieben verwendet hier eine sehr einfache Messung der die spontane schlagen bei HiPSC-CM zum möglichen Drogenwirkungen auf menschliche kardiale Elektrophysiologie auswerten. Seine wesentlichen Vorteile gegenüber anderen Methoden ist, dass (i) es zu einer Hochdurchsatz-Screening-Umgebung ist, Ii) die Aktivität der Herzmuskelzellen und die Auswirkungen von Drogen bei physiologischen Temperaturen zeichnet und (Iii) Es ist nicht erforderlich Elektrophysiologische Kompetenz für die Ausführung oder für eine Bewertung der Ergebnisse.

In einer Validierungsstudie durchgeführt mit vielen Medikamente, die für den menschlichen Gebrauch zugelassen haben wir gezeigt, dass der Test auf Medikamente, die in der Humanmedizin als vorhergesagt von vorhandenen klinischen Daten5reagiert. Da diese Methode alle mögliche Auswirkungen auf Herzrhythmus ansieht, ergänzt es die umfassende in-vitro- Proarrhythmic Assay (CiPA) Initiative14 , die speziell Pro arrhythmischen Potenzial beurteilt.

In Zukunft könnten diese Methode eine weitere Verständnis der Modus der Aktion von Medikamenten gezeigt, dass die spontane schlagen Rate beeinflussen. Es ist wahrscheinlich, dass mechanistische Zusatzinformationen in den Fluoreszenz-Aufnahmen von Ca Transienten (z. B.in ihrer Amplitude oder Form) vorhanden ist. Wenn die Fluoreszenz-Aufnahmen durchgeführt werden bei höheren Erfassungsraten (z.B. 30 Hz), diese Parameter werden leicht extrahiert neben Rate zu schlagen, und es kann interessant sein, mit den bekannten Wirkungen von Änderungen dieser Parameter korrelieren klinisch Drogen konsumiert.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

FDSS7000 fluorescent plate reader Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 installed initially
in the device
FDSS7000 temperature control Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 U8524-12 optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software Wavemetrics
(Portland, Oregon, USA)		 Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit Cellular Dynamics International (Madison, WI) R1106 includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit Ncardia Germany
(Cologne, Germany)		 Ax-B-HC02-4M includes cells, plating and maintenance media
alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781091
384-well compound plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit Molecular Devices
(Sunnyvale, California)		 R8142
Forskolin Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 F6886
N6-cyclopentyl-adenosine Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 C8031
E-4031 Enzo Life Sciences
(Lausen, Switzerland)		 BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15250061
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References

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Human-iPSC-derived CardiomyocyteCardiac Safety PharmacologyTemperature-controlled 384-well PlatesCa-sensitive Fluorescent DyeSyncytia ContractionsCell CultureMaintenance MediumCompound Plates

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Forny, C., Sube, R., Ertel, E. A. Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates. J. Vis. Exp. (140), e58290, doi:10.3791/58290 (2018).
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