Contracties van mens-iPSC-afgeleide Cardiomyocyte Syncytia gemeten met een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof in temperatuurgevoelig 384-Wells-platen

1. bereiding van de platen van de cel Opmerking: Bereiden de cel platen 3-4 weken voor het meten van effecten van de drug. Dag 0 van het experimentOpmerking: voor planningsdoeleinden, de samengestelde toepassing van de test kan worden uitgevoerd op elke dag tussen dagen 22-28 van het experiment. Zet het waterbad bij 37 ° C en 40 mL van plating medium warm (zoals geleverd door de fabrikant).Opmerking: Gebruik de cellen met hun leverancier geleverde overeenkomende cultuur en onderhoud media. Ontdooi de hiPSC-CM door het plaatsen van de cryotubes met bevroren cellen in het waterbad gedurende 2 minuten. Overbrengen in de 1 mL cel schorsingen zorgvuldig een kegelvormige tube van 50 mL. Wassen elke cryotube met 1 mL van warme plating medium voor het ophalen van de overgebleven cellen en het wassen media toevoegen aan de dezelfde conische buis uit stap 1.1.3 met cellen. Meng zorgvuldig een andere 8 mL warme plating medium in de celsuspensie. Levende cellen met behulp van de methode trypan blauwe uitsluiting en een hematocytometer8tellen.Opmerking: de eis van 6 x 106 cellen voor een 384-well cel plaat acht de mogelijkheid om maximaal 20% dode cellen onder de bevroren cellen, die een maximum in onze ervaring. Aanpassen van de celsuspensie tot 5 x 105 levende cellen/mL met het warme plating-medium. Het verdelen van de celsuspensie over twee 384-well cel platen door 25 µL toe te voegen aan elk putje (ongeveer 12.500 cellen per putje).Opmerking: De cel platen hoeft niet te worden voorgelakt met een matrix (Zie discussie). De platen van de cel bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2handhaven. Dag 1 van het experiment Inschakelen van het waterbad bij 37 ° C en warme 50 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing. Het medium van de beplating vervangen door 50 µL van warme onderhoud medium in elk putje van de platen van de cel. Dagen 2-21 (tot dag 27) van het experimentOpmerking: de hiPSC-CMs hoeft niet elke passaging in deze periode, zoals ze niet-delende zijn cellen. Vernieuwen de helft van het onderhoud medium elke 2-3 dagen en vernieuwen het volledig op dagen 7, 14 en 21.Opmerking: De fluorescentie-meting kan worden uitgevoerd tussen dagen 22 en 28 van het experiment. Langere duur hebben niet geprobeerd maar kunnen nog wel goed. 2. voorbereiding van het Instrument, samengestelde platen en Assay platen Opmerking: bereiden van het instrument, samengestelde platen en assay platen op de dag van de waardering van effecten van de drug, tussen dagen 22 en 28 van het experiment. Gebruik een fluorescerende afleesapparaat uitgerust met temperatuurregeling en een passende fluorescentie filter kit en excitatie licht bron. Gebruik bijvoorbeeld een Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescentie filter kit (excitatie: 472 nm, emissie: 520-560 nm) en een 150 W excitatie lichtbron eenheid. Ten minste 2 uur voordat de eerste plaat van de cel moet worden geplaatst binnen de afleesapparaat voor de meting, zet de lezer en selecteer het verwarmingssysteem bij 37 ° C.Opmerking: dit kan ook de avond vóór. Voorbereiding van de positieve controles, forskolin N6-cyclopentyl-adenosine en E-4031 als stamoplossingen van 0.33 mM in DMSO, 10 mM in DMSO, en 3,33 mM H2O, respectievelijk.Opmerking: voorraad oplossingen zal worden verdund 333-fold tegen de tijd dat ze worden toegevoegd aan de cellen, en het doel is om de laatste testconcentraties van 1 µM forskolin, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosine, en 10 µM E-4031, die betrouwbare en reproduceerbare effecten produceren. Bereiden de 352 test verbindingen als DMSO stamoplossingen op 333-fold de geplande testconcentraties (bijvoorbeeld10 mM voor een test op 30 µM).Opmerking: Het doel is om een eindconcentratie van 0,3% (v/v) DMSO in de cel plaat na de samengestelde toepassing; Dit is de hoogste concentratie van DMSO, dat heeft geen invloed op de ritmische activiteit van de cardiomyocytes. De voorraadoplossingen kunnen ook worden bereid van eergisteren. Een minimum van 5 µL van stockoplossing is vereist voor elke dubbele meting. De samengestelde platen voor te bereiden. Verwarm 40 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing tot kamertemperatuur. Verdelen over twee 384-well samengestelde platen door het toevoegen van 1,5 µL van stockoplossing per putje: i) de test verbindingen (elke twee putten), ii) de positieve controle (forskolin N6-cyclopentyl-adenosine en E-4031, vier wells per samengestelde plaat) en iii) de negatieve controle (DMSO, 20 wells per samengestelde plaat). Centrifugeer de samengestelde platen bij 100 x g gedurende 1 minuut. 37 µL van onderhoud medium op kamertemperatuur toevoegen aan elk putje (3,9% DMSO in 38.5 µL in dat stadium). Centrifugeer de samengestelde platen bij 100 x g gedurende 1 minuut. De samengestelde platen in de afleesapparaat laden.Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd zo spoedig mogelijk om te minimaliseren van de verdamping in de samengestelde platen. De fluorescente kleurstof voor te bereiden. Inschakelen van het waterbad bij 37 ° C en warme 100 mL onderhoud voedingsbodem aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine oplossing. Het reconstrueren van de Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en quencher met 10 mL warme onderhoud medium met antibiotica.Opmerking: deze voorraad fluorescentie-medium bevat de fluorescente kleurstof van Ca-gevoelige, meestal Fluo-4 en een quencher, en eventuele overgebleven kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ten minste 5 dagen. 3. data-acquisitie Opmerking: de data-acquisitie uitvoeren op de dag van de waardering van effecten van de drug. Stappen 3.1-.10 geheel voor de eerste cel plaat, dan herhalen voor de tweede plaat van de cel. Start de plaat reader-software (indien nodig) en laadt u de uiteinden van de pipet. Pas de instellingen van de software als u wilt opnemen van een segment van de 2 min van Calcium golven met een frequentie van de acquisitie van ten minste 10 Hertz te definiëren van de basislijn kloppend tarief voor elk putje. Verdun voor één cel plaat, 3 mL voorraad fluorescentie voedingsbodem in 12 mL warme onderhoud medium met antibiotica om het medium van de fluorescentie. 20 µL van medium in elk putje van de plaat van de cel vervangen door 30 µL van fluorescentie medium. Pipetteer op en neer 1 x te mengen. Plaats de plaat van de cel in de afleesapparaat zo snel mogelijk te laten de hiPSC-CM acclimatiseren aan de temperatuur. 60 min wachten voordat de data-acquisitie. Start de data-acquisitie in de plaat lezerssoftware voor het registreren van een segment van de 2 min van Ca golven met een frequentie van de acquisitie van ten minste 10 Hz, tot het definiëren van de basislijn verslaan tarief voor elk putje.Opmerking: voor elke opname sequentie, zorg ervoor dat de cel plaat is niet automatisch overgebracht uit het apparaat na de data-acquisitie. Hiermee voorkomt u dat de cel plaat koeling bij kamertemperatuur. Bij sommige versies van de software van de lezer van de plaat, kan het nodig om te stoppen met elke opname voordat het eindigt volledig om dit te bereiken zijn. Toevoegen van de teststof en de referentiestof verbindingen met de plaat lezer robot door goed-te-goed 5 µL van de samengestelde plaat in de cel plaat pipetteren (na toevoeging, de concentratie van DMSO is 0,3% [v/v]). Start de data-acquisitie in de plaat reader software om record 2 min segmenten van Ca golven beginnen over 5, 15, 30, 45 en 60 min na de samengestelde toevoeging (zorg ervoor dat elke keer dat de cel plaat blijft in het apparaat). 4. de gegevensanalyse Opmerking: de data-analyse een willekeurig tijdstip na de meting kan worden uitgevoerd. De ruwe gegevens voor elke periode van de opname van de software van de lezer van de plaat als ASCII-tekstbestanden exporteren. De ruwe gegevens in de software van de analyse van de gegevens te importeren. Voor elk putje en alle tijdstippen, pak de primaire kloppend frequentie.Opmerking: Met de data-analysesoftware vermeld in de Tabel van materialen, het verslaan van frequenties kan worden berekend met een routine van de aangepaste analyse met behulp van de functie van de LombPeriodogram, gebaseerd op de Lomb-Scargle methode van kleinste kwadraten spectrale analyse7 . De periodogram moet worden berekend voor een bereik van frequenties tussen 0,01 en 5 Hz. De primaire frequentie kan worden geëxtraheerd uit de periodogram met behulp van de PeakAutoFind routines. Deze analysemethode biedt meer nauwkeurige metingen van frequenties dan de methode geleverd als een optie met de software van de lezer van de plaat te verslaan. De laatste kan echter nog steeds worden gebruikt als de aanpassing van de software geen optie is. Exporteren de frequenties van de primaire kloppend voor elke periode van de opname van de software van de analyse van de gegevens als Klembord kopieën of als ASCII-tekstbestanden. De primaire kloppend frequenties in een spreadsheet-software importeren door Klembord plakken of tekst bestand importeren.Opmerking: stappen 4.5-4.9 in elke moderne spreadsheet-software kunnen worden uitgevoerd. Voor elk putje, normaliseren tot basislijn de afstraffing frequentie op elk tijdstip na de toepassing van de drug (5, 15, 30, 45 en 60 min) door het verdelen van de frequentie van de primaire kloppend op dat moment punt door de frequentie van de primaire kloppend op basislijn. Berekenen van het gemiddelde effect van DMSO op elk tijdstip na de toepassing van de drug (5, 15, 30, 45 en 60 min) door het gemiddelde van de genormaliseerde waarden voor de 20 putten waar DMSO werd toegepast. Voor elk putje en telkens na de toepassing van de drug punt (5, 15, 30, 45 en 60 min), de gemiddelde DMSO effect (tijd-overeenkomst) voor de dezelfde plaat aftrekken. Het gemiddelde van de dubbele metingen.Opmerking: als een verbinding verandert de frequentie of de software niet kan een primaire frequentie na de samengestelde toevoeging vinden, een visueel onderzoek van het patroon van de afstraffing kan beoordelen of de stof aritmieën geproduceerde.