Схватки Syncytia человека iPSC производные Cardiomyocyte измеряется с Ca чувствительных Люминесцентную краску в контролируемой температурой 384-ну пластины
Summary
Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированные плюрипотентные стволовые клетки являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Здесь мы представляем систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения эффектов экзогенных соединений на избиение частоты, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя.
Abstract
Спонтанно Договаривающихся syncytia кардиомиоцитов, производный от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC см) являются полезной модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. Были предложены различные методы для записи этой спонтанной активности и оценить эффекты наркотиков, но многие из этих методов страдают от ограниченной пропускной способности и/или физиологической значимости. Мы разработали систему высокопроизводительного скрининга для количественного определения воздействия внешних соединений на hiPSC-CM частоты биений, используя Ca чувствительных Люминесцентную краску и контролем температуры изображений несколькими хорошо пластины читателя. Мы опишем, как подготовить сотовый плит и составные пластин и как запускать автоматизированные assay для достижения высокой чувствительностью и воспроизводимость. Мы также описывают, как для преобразования и анализа данных флуоресценции для предоставления надежных мер воздействия препарата на спонтанный ритм. Этот assay может использоваться в программах обнаружения наркотиков для руководства химических оптимизация, или выгнутых, соединений, влияющих на функции человеческого сердца.
Introduction
Настоящий Протокол описывает метод для измерения воздействия наркотиков на частоте спонтанных избиение syncytia hiPSC-см на физиологически соответствующих ритмов. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток могут дифференцироваться в функциональных кардиомиоцитов, которые устанавливают спонтанно syncytia избиение в пробирке3,1,2,4. Эти hiPSC см могут быть получены в большом количестве через коммерческих провайдеров или производства в лаборатории, и они являются полезным источником клеток для создания модели человеческого сердца физиологии и фармакологии. В частности они могут использоваться для прогнозирования или характеризовать сердечных эффектов, которые могут произойти, когда препарат вводят людей5.
Частота биений hiPSC-CM syncytia может быть измерена в физиологических условиях, с использованием микроэлектродные массивы или импеданса зондирования1: эти неинвазивные методы обеспечивают очень подробную информацию о воздействии наркотиков, но они скорее низкая пропускная способность и они не позволяют тестирование большого комплекса библиотек в реалистичные сроки и бюджетные ограничения. Более эффективной системы может быть разработан с использованием 384-ну флуоресценции воображения читателя пластины и Ca чувствительных красителя6, но классическая пластины читателей препятствуют субоптимальные температуры контроля и приобретение частоты. Эти ограничения могут быть проиллюстрированы unphysiological избиение ставки (~ 15 bpm, по сравнению с 35-55 bpm в контролируемых условиях1) и бедных Ca разрешение сигнала (приобретение частота 8 Гц — нижний предел для записи ставки, которые могут достигать 120 bpm стимулируется условиях, и не может извлекать информацию, такую как склон или длительность). Метод, описанный здесь сочетает в себе запись избиения узоры на физиологические ритмы и достаточным разрешением для предотвращения этих проблем.
На положительной стороне этот метод является простым, надежным и высокой пропускной способности, которая позволяет быстрое тестирование большого числа соединений по разумной цене. На отрицательной стороне этот метод требует Быстрый плита читателя с эффективной температуры, который является дорогим инвестиций, и он содержит мало механистический информацию о наблюдаемых наркотиков эффекты, которые могут потребовать дальнейших испытаний с более подробными методы.
Для одного измерения в одном плита клетки 384-ну необходимо приблизительно 6 x6 hiPSC 10СМ. hiPSC см обычно поставляются коммерчески замороженных аликвоты ~ 4 x 106 клеток в 1 мл. Таким образом это удобно подготовить две ячейки пластины с тремя замороженными аликвоты. В большинстве случаев, вследствие низкой изменчивости этот assay, это достаточно для выполнения повторяющихся измерений испытаний соединений и в каждой ячейке пластина, quadruplicate измерения положительных элементов управления (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031), и 20-складчатых измерения отрицательного контроля (ДМСО только). Таким образом максимум 352 соединения/концентрации пар может оцениваться с двумя пластинами 384-ну клеток. Следующий протокол считает такой эксперимент с 352 тест соединения, две клетки пластины и 12 миллионов клеток, поставляется как три аликвоты замороженные; Это может быть легко увеличен, если нужны дополнительные данные точек.
Protocol
Representative Results
Discussion
Два аспекта являются наиболее важными для успешной записи избиения частоты. Первый — проявлять осторожность с обшивкой клеток и культуры. В частности важно, чтобы попытаться избежать царапин слоя клеток в нижней части скважины при обмене среды. Это приемлемо для сенсорных в нижней части скважины с пипетки, но тот же угол должен использоваться каждый раз, тем самым производить только крошечные нуля в слой клетки и не влияет на производительность assay. Второй критический аспект получения воспроизводимых однородной ритмов является предоставление контроля температуры при 37 ° C на пластину клеток в течение измерения. Мы не могли получить эта однородность, использование устройств за исключением читателя пластины, используемые здесь, но это может быть возможным с специальные модификации для регулирования температуры: было бы сделать протокол, здесь представлены более широко использоваться за пределами единого бренда пластины читатель. Для достижения стабильности температуры в течение всего эксперимента с устройством, используемый здесь, было необходимо остановить каждую запись, прежде чем она закончилась; в противном случае робот будет извлечь измеренной пластину ячейки. Этот технический вопрос может исчезнуть в следующем выпуске программного обеспечения читателя пластины, но сейчас он остается критическим. Если плита клетки ошибочно передается вне читателя плита, он должен быть загружен обратно внутрь как можно быстрее. Тем не менее качество этого эксперимента будут ухудшаться, потому что изменения температуры влияют на скорость избиение чрезвычайно быстро.
Некоторые другие аспекты, которые не были тщательно протестированы, могут быть менее важными. Например hiPSC см производители рекомендуют покрытие культуры клеток пластины перед посевом клетки, но в этой конкретной assay, покрытие не используется, потому что клетки придерживаются довольно легко на различных поверхностях, и это очень трудно правильно пальто 384-Ну плиты. Тем не менее клеток плиты покрытия все еще может быть допустимой, или это может даже улучшить качество анализа. Мы также никогда не испытывал ли растворителей помимо ДМСО будет приемлемым, но из опыта с другими технологиями записи ожидается, что аналогичные концентрации EtOH или метанола также будет терпимой. Мы обычно используем hiPSC-CMs от того же производителя, и были протестированы клетки от только одного дополнительного поставщика, который, как представляется, работают аналогичным образом. Кроме того мы использовали лишь небольшое количество различных серий hiPSC-CMs, которые были выбраны путем prechecking их, чтобы убедиться, что они вели себя подобным образом в первоначальный пакет. Один или два пакетов были сочтены неуместными, потому что их syncytia бедных стабильность и воспроизводимость в условиях культуры используется здесь. В противном случае фармакологии появился очень похож по всей партии, при тестировании ограниченной группы «типичного» соединений (форсколин, N6-cyclopentyl аденозин и E-4031, а также эндотелина, isoproterenol, амлодипина и ponesimod). Мы только использовали hiPSC-CM, полученные от здоровых доноров. Это может быть целесообразным оценить ли hiPSC-CM, полученных от пациентов с заболеваниями сердца будет предоставлять различные результаты, хотя никакой разницы между здоровых доноров и пациентов наблюдалось при оценке кардиотоксичности ингибитора киназы тирозина 12. и наконец, мы обычно ждать 22 – 28 дней в культуре до измерения наркотиков эффекты: в нашем опыте с записями сопротивления те же клетки, установившемся для медленно импеданс (показатель стабильности слоя клеток) и быстро импеданса (показатель избиение частоты) достигается после 12–15 дней в культуре. Однако мы решили ждать 22–, 28 дней, потому что это время, когда выражение профиль сердца каналов и маркеры созревания стабилизировалась13. Он не рассматривался ли сопоставимые результаты будут получены, если клетки использовались раньше или позже.
Протокол, в описанный здесь использует очень простой измерения скорости спонтанного избиение hiPSC см для оценки потенциального воздействия препарата на человека сердечной электрофизиологии. Его основные преимущества перед другими методологиями, что i) оно поддается среде высокопроизводительного скрининга, ii) он записывает деятельность кардиомиоцитов и эффекты препаратов при физиологических температурах, и iii) не требует Электрофизиологические опыт для выполнения или для оценки результатов.
В исследовании проверки выполняется с много лекарств, одобренных для использования человеком мы показали, что assay реагирует на лекарства, используемые в человеческой медицине как предсказано существующих клинических данных5. Так как этот метод учитывает все потенциальные последствия для сердечного ритма, он дополняет всеобъемлющий в пробирке Proarrhythmic проба (CiPA) инициативы14 , специально оценивает про аритмических потенциал.
В будущем этот метод может обеспечить дальнейшее понимание режима действия препаратов, показано, что влияет на уровень спонтанной избиение. Вполне вероятно, что дополнительные механистическая информация присутствует в флуоресценции записей Ca транзиентов (например, в их амплитуда или форму). Если флуоресценции записи выполняются на более высокие цены приобретения (например, 30 Гц), эти параметры легко извлекаются помимо избиение скорость, и это может быть интересно соотнести изменения этих параметров с известных последствий клинически употребляли наркотики.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| FDSS7000 fluorescent plate reader | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
not a catalog item | |
| FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
installed initially in the device |
|
| FDSS7000 temperature control | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A10118-09 | |
| FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
C11653-11 | |
| FDSS7000 pipet tips for 384-well plates | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A8687-62 | |
| Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
U8524-12 | optional alternative to the Igor Pro software |
| Igor Pro data analysis software | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) |
Latest version | |
| iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | includes cells, plating and maintenance media |
| Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (Cologne, Germany) |
Ax-B-HC02-4M | includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes |
| 384-well cell culture plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
| 384-well compound plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
| FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) |
R8142 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
F6886 | |
| N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
C8031 | |
| E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) |
BML-KC158 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15250061 |
References
- Guo, L. Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).
- Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes. Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).
- Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).
- Ma, J. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- Sube, R., Ertel, E. A. Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells: An In-Vitro Model to Predict Cardiac Effects of Drugs. Journal of Biomedical Science and Engineering. 10 (11), 23 (2017).
- Sirenko, O. Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells. Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).
- VanderPlas, J. T. Understanding the Lomb-Scargle Periodogram. Cornell Univeristy Library. , (2017).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Ertel, E. A., Godfraind, T., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. Calcium Channel Blockers. , 11-80 (2004).
- Sanguinetti, M. C. Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs. Hypertension. 19, 228-236 (1992).
- Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels. Marine Drugs. 15 (10), (2017).
- Sharma, A. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Puppala, D. Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell–derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue. Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).
