Summary

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Published: October 24, 2018
doi:

Summary

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능

Abstract

상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.

Introduction

안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.

각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.

전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막10,11, 의 사용에 의존 해야 12 , 13 , 14 , 15. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입19,20,,2122, 23. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.

이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.

Protocol

탐 페 레 대학의 인간 배아에 대 한 연구를 수행 하 핀란드 (Dnro 1426/32/300/05) 법의학 담당 국가 기관의 승인이 있다. 연구소는 또한 파생, 문화, 및 hESC 라인 (Skottman/R05116)를 차별화 하 고 안과 연구 (Skottman/R14023)에서 hiPSC 라인을 사용 하는 Pirkanmaa 병원의 윤리 위원회의 지원 문이 있다. 아니 새로운 셀 라인은이 연구에 대 한 파생 되었다. 참고: 설명 프로토콜 기반으로 특정, 상용…

Representative Results

HPSC-LESCs에 hPSCs에서 FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 …

Discussion

이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.

Materials

Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ Gibco #14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ Lonza #17-512F/12
100 mm cell culture dish Corning CellBIND #3296 Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plate Corning CellBIND #3336 Culture vessel format for IF samples
24-well plate Corning CellBIND #3337 Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanol Gibco #31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachment Corning Costar #3471 Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-21202 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig ThermoFisher Scientific #A-21206 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat Ig ThermoFisher Scientific #A-11057 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-10037 Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) PeproTech Inc. #AF-100-18B Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution BD Biosciences #554722 Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences #554723 Washing buffer for flow cytometry
Blebbistatin Sigma-Aldrich #B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) PeproTech Inc. #120-05A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #A8022-100G
Cytokeratin 12 antibody Santa Cruz Biotechnology #SC-17099 Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibody R&D Systems #MAB3164 Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibody ThermoFisher Scientific #MS-1068-P Primary antibody for IF
CnT-30 CELLnTEC Advanced Cell Systems AG #Cnt-30 Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human) Sigma-Aldrich #C5533 Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing Container Sigma-Aldrich #BCS-405
CryoPure tubes Sarsted #72.380 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin Inhibitor Gibco #R-007-100
Essential 8 Flex Medium Kit Thermo Fisher Scientific #A2858501
GlutaMAX Gibco #35050061
Laminin 521 Biolamina #Ln521 Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibody BioCare Medical #4892 Primary antibody for IF
OCT3/4 antibody R&D Systems #AF1759 Primary antibody for IF
p63α antibody Cell Signaling Technology #ACI3066A Primary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) Cell Signaling Technology #56687 p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibody Sigma-Aldrich #HPA030775 Primary antibody for IF
Penicillin/Streptomycin Lonza #17-602E
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich #158127 Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific #P36931 DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific #A2644601
TrypLE Select Enzyme Gibco #12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco #10829018
KnockOut SR XenoFree CTS Gibco #10828028
MEM non-essential amino acids Gibco #11140050
SB-505124 Sigma-Aldrich #S4696
Triton X-100 Sigma-Aldrich #T8787 Permeabilization agent for IF
VectaShield Vector Laboratories #H-1200 DAPI mountant for liquid mounting for IF
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II Tharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 Olympus

References

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Hongisto, H., Vattulainen, M., Ilmarinen, T., Mikhailova, A., Skottman, H. Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (140), e58279, doi:10.3791/58279 (2018).

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