Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Этот протокол вводит метод простой двухступенчатый для дифференциации роговицы нейральные стволовые клетки эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток xeno – и фидер культуры клеток свободных условиях. Представленные здесь методы культуры клетки позволяют экономически эффективным, крупномасштабного производства клинической качества клеток роговицы клетки терапии применение.
Abstract
Роговицы нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs) несут ответственность за постоянно обновление эпителия роговицы и таким образом поддержание гомеостаза роговицы и четкость. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных LESCs обеспечивают перспективный источник клеток для роговицы клеточной терапии замены. Неопределенным, культивированная культуры и дифференциации условия вызывают различия в результатах исследования и препятствуют клинический перевод hPSC производные терапии. Этот протокол обеспечивает воспроизводимость и эффективный метод для hPSC-LESC дифференциация xeno – и условиях подачи клеток бесплатно. Во-первых монослойном культивировании недифференцированные hPSC на рекомбинатных Ламинин-521 (LN-521) и определено hPSC средне служит основой для надежного производства высокого качества исходного материала для дифференцирования. Во-вторых быстрый и простой hPSC-LESC метод дифференциации дает LESC населения в всего 24 дней. Этот метод включает в себя четыре дня поверхности эктодермы индукции в подвеску с малых молекул, следуют адэрентных культуры фазы LN-521/коллаген IV сочетание матрицы в среде определенных эпителия роговицы дифференциации. Cryostoring и расширенной дифференциация далее очищает популяции клеток и позволяет банковских ячеек в больших количествах для продуктов терапия ячейки. Результате высокого качества hPSC-LESCs обеспечивают потенциальные стратегии Роман лечения для роговицы поверхности реконструкции для лечения дефицита нейральные стволовые клетки (LSCD).
Introduction
Прозрачной роговицы в глазной поверхности позволяет свету войти сетчатки и предоставляет большинство преломляющей способности глаз. Внешний слой, пробужденные эпителия роговицы, непрерывно регенерируется путем нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs). LESCs находятся в базальный слой послабляющие ниш на Корнеосклеральный перекрестке1,2. LESCs отсутствуют конкретные и уникальные маркеры, поэтому их идентификации требует более широкого анализа ряда putative маркеров. Эпителиальных транскрипционным фактором p63 и особенно N-неизлечимо усеченного Стенограмма альфа изоформы p63 (ΔNp63α), было предложено как соответствующие позитивные LESC маркер3,4. Асимметричным разделением LESCs позволяет им самостоятельно обновить, но и производят потомство, что перенос centripetally и кпереди. Как клетки прогресса к поверхности роговицы, они постепенно теряют свою stemness и наконец неизлечимо дифференцировать в поверхностные клетки плоского эпителия, которые постоянно теряются от поверхности роговицы.
Повреждение в любом из слоев роговицы может привести к тяжелой зрительные нарушения, и дефекты роговицы, таким образом, одной из ведущих причин потери зрения во всем мире. В дефицит нейральные стволовые клетки (LSCD) лимба уничтожается болезнь или травма, которая приводит к conjunctivalization и помутнение роговицы поверхности и последующая утрата зрения5,6. Клеточная терапия замены с помощью аутологичных и аллогенных послабляющие графтов предлагает стратегии лечения для пациентов с LSCD4,,78,9. Однако уборки аутологичных трансплантатов несет риск осложнений для здорового глаза, и донорской ткани не хватает. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), специфически человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), может служить неограниченный источник типов клинически значимых клеток, включая роговицы эпителиальных клеток. Таким образом hPSC производные LESCs (hPSC-LESCs) представляют собой привлекательный новый источник клеток для глазной клеточной терапии замены.
Традиционно недифференцированные hPSC культура методы и их дифференциация протоколы для LESCs полагаются на использование неопределенных фидер клетки, животных сера, кондиционером СМИ или амниотической мембраны10,11, 12 , 13 , 14 , 15. Недавно, усилия в направлении безопасные продукты терапии клеток побудили Поиск более стандартизированных и бесплатная xeno протоколы культуры и дифференциации. В результате несколько определенных и xeno бесплатные методы для долгосрочного культуры недифференцированные hPSCs в настоящее время коммерчески доступных16,17,18. Как континуум, направленного дифференцирования, протоколы, полагаясь на молекулярные сигналы для руководства hPSCs эпителия роговицы судьбы были недавно представил19,,21,20,22, 23. Еще многие из этих протоколов используется либо неопределенным, hPSCs на основе подачи как начиная материал, или комплекс, культивированная фактор роста коктейли для дифференциации.
Этот протокол предназначен для предоставления надежной, оптимизированный, xeno- и фидер свободный hPSC культуры метода и последующего дифференциации роговицы LESCs. Однослойная культуре плюрипотентных hPSCs на Ламинин-521 (LN-521) матрицы в среде определенных, альбумин бесплатные hPSC (в частности основных Flex 8) позволяет быстрое производство однородной исходным материалом для дифференцирования. После простой, двухступенчатый дифференциации стратегия руководства hPSCs к поверхности эктодермы судьба в суспензии, следуют адэрентных дифференциации в LESCs. Популяции клеток, где > 65% Экспресс ΔNp63α получается в течение 24 дней. Xeno – и фидер свободно протокол был протестирован с несколькими линиями hPSC (ЭСК и hiPSCs), без требования для оптимизации конкретной линии клеток. Протоколы для свободной выходные обслуживания, пассированый, cryostoring и hPSC-LESC фенотип, описанные здесь позволяют производство больших серий LESCs высокого качества для клинических или исследовательских целях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ожидаемый результат этого протокола является успешным и надежным поколения LESCs от одной ячейки приостановления FF hPSC в течение приблизительно 3,5 недель. Как эпителий роговицы развивается от поверхности эктодермы29, первый шаг протокола направлена на рулевое hPSCs к этой линии…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано в Академии Финляндии (Грант № 297886), человека запасных частей программа Tekes, Финское агентство финансирования технологий и инноваций, Финский глаз и фонд банка тканей и финский культурный фонд. Авторы благодарят биомедицинских лаборантов Ути Мелин, Ханна Pekkanen, Эмма Vikstedt и Ути Хейккиля отличную техническую помощь и вклад в культуру клеток. Профессор Katriina Аалто-Сетала признается за предоставление hiPSC линии и BioMediTech Imaging основного фонда для предоставления оборудования для флуоресценции изображений.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
