Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Questo protocollo introduce un metodo in due semplici passaggi per la differenziazione delle cellule staminali corneali epiteliali limbal da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza cellula di xeno – e alimentatore. I metodi di coltura cellulare presentati qui abilitare produzione costo-efficiente, su larga scala di celle di qualità clinica applicabili all’utilizzo di terapia corneale delle cellule.
Abstract
Le cellule staminali epiteliali limbal corneale (LESCs) sono responsabili per rinnovare continuamente l’epitelio corneale e mantenendo così l’omeostasi cornea e la chiarezza visiva. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-derivata LESCs forniscono una promettente fonte di cellule per terapia sostitutiva delle cellule corneali. Indefinito, xenogeniche cultura e differenziazione condizioni causano variazione nei risultati di ricerca e ostacolano la traslazione clinica terapeutica hPSC-derivato. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per il differenziamento di hPSC-LESC in condizioni senza cellula xeno – e alimentatore. In primo luogo, cultura dello strato monomolecolare di hPSC indifferenziato il ricombinante laminin-521 (LN-521) e definito hPSC medio costituisce la base per la produzione di robusta di alta qualità materiale di partenza per differenziazioni. In secondo luogo, un metodo di differenziazione rapida e semplice hPSC-LESC produce popolazioni LESC in soli 24 giorni. Questo metodo include un’induzione superficie ectodermica di quattro giorni in sospensione con piccole molecole, seguita dalla fase di coltura aderente sulla matrice di combinazione di LN-521/collagene IV nel mezzo di differenziazione epiteliale corneale definiti. Cryostoring e differenziazione estesa ulteriormente purifica la popolazione delle cellule e consente bancari delle cellule in grande quantità per i prodotti di terapia cellulare. La risultante hPSC-LESCs di alta qualità forniscono una potenziale strategia di trattamento novello per la ricostruzione della superficie corneale per il trattamento di mancanza limbal della cellula formativa (LSCD).
Introduction
La cornea trasparente sulla superficie oculare permette alla luce di entrare la retina e fornisce la maggior parte del potere refrattivo dell’occhio. Lo strato più esterno, l’epitelio cornea stratificato, è continuamente rigenerato con le cellule staminali epiteliali limbal (LESCs). Il LESCs risiedono nello strato basale delle nicchie limbal al corneoscleral giunzione1,2. LESCs mancano marcatori specifici e unici, quindi la loro identificazione richiede un’analisi più ampia di una serie di markers putativi. P63 di fattore di trascrizione epiteliale e soprattutto N-terminalmente troncato trascrizione dell’isoforma alfa di p63 (ΔNp63α), è stato proposto come un rilevante positivo LESC segnapunti3,4. Divisione asimmetrica di LESCs permette loro di auto-rinnovarsi, ma anche produrre progenie che migrano centripeto e anteriormente. Come le cellule procede verso la superficie cornea hanno gradualmente perdere loro staminalità e infine terminalmente differenziare a cellule squamose superficiali che vengono continuamente perse dalla superficie cornea.
Danno ad uno qualsiasi degli strati corneali può portare a grave deficit visivo, e i difetti corneali sono dunque una delle principali cause di perdita di visione in tutto il mondo. Nella mancanza limbal della cellula formativa (LSCD), il limbus è distrutto da malattia o trauma che porta a conjunctivalization e opacizzazione della superficie corneale e la conseguente perdita di visione5,6. Terapia di sostituzione cellulare usando gli innesti limbal autologhi o allogenici offre una strategia di trattamento per i pazienti con LSCD4,7,8,9. Tuttavia, raccolta innesti autologhi sopporta un rischio di complicazioni per l’occhio sano e tessuto erogatore scarseggia. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), in particolare cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), può servire come una fonte illimitata di cellule clinicamente rilevanti, comprese quelle cellule epiteliali corneali. HPSC-derivato LESCs (hPSC-LESCs) rappresentano quindi una fonte interessante di cellulare nuovo per terapia sostitutiva delle cellule oculari.
Tradizionalmente, sia i metodi di coltura hPSC indifferenziato ed i loro protocolli di differenziazione di LESCs hanno fatto affidamento sull’uso di cellule di alimentatore indefinito, sieri animali, terreni condizionati o membrane amniotiche10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, gli sforzi verso prodotti di terapia cellulare più sicuri hanno spinto alla ricerca di più protocolli standardizzati e xeno-libero Cultura e differenziazione. Di conseguenza, diversi metodi definiti e privo di xeno per coltura a lungo termine di hPSCs indifferenziato ora sono commercialmente disponibili16,17,18. Come un continuum, differenziazione diretto protocolli basandosi su indizi molecolare per guidare l’hPSCs al destino epiteliale cornea sono stati recentemente introdotti19,20,21,22, 23. Ancora molti di questi protocolli utilizzati entrambi hPSCs alimentatore basata indefinita, come materiale, o fattore di crescita del complesso, xenogeniche cocktail per differenziazione di partenza.
Lo scopo del presente protocollo è quello di fornire un robusto, ottimizzato, xeno- e metodo di coltura hPSC privo di alimentatore e successiva differenziazione di LESCs corneale. Cultura dello strato monomolecolare di pluripotent hPSCs il laminin-521 (LN-521) matrice in mezzo hPSC definito, privo di albumina (in particolare essenziale 8 Flex) permette la rapida produzione di materiale omogeneo partenza per differenziazioni. Da allora in poi una semplice strategia di differenziazione in due fasi guide hPSCs verso la superficie ectodermico destino in sospensione, seguita da differenziazione aderente a LESCs. Una popolazione di cellule dove > 65% express ΔNp63α è ottenuta entro 24 giorni. Il protocollo privo di xeno e alimentatore è stato testato con diverse linee di hPSC (hESC e hiPSCs), senza alcun requisito per ottimizzazione specifica cella linea. I protocolli per il week-end senza manutenzione, passaggio, cryostoring e hPSC-LESC phenotyping qui descritte consentono la produzione di grandi lotti di LESCs di alta qualità per cliniche o scopi di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il risultato previsto del presente protocollo è la generazione robusta e di successo di LESCs da una sospensione unicellulare di FF hPSC entro circa 3,5 settimane. Come epitelio corneale si sviluppa dalla superficie ectoderma29, il primo passo del protocollo mira a sterzo hPSCs verso questo lignaggio. Un’induzione di breve 24h con trasformazione di fattore di sviluppo beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF sono utilizzati per indurre la differenziazione ectodermica, seguita da spunto di BMP-4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dell’Accademia di Finlandia (concessione numero 297886), il programma di pezzi di ricambio umani di Tekes, l’agenzia finlandese di finanziamento per la tecnologia e l’innovazione, l’occhio finlandese e Tissue Bank Foundation e la Fondazione culturale finlandese. Gli autori ringraziano i tecnici di laboratorio biomedico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä per assistenza tecnica eccellente e contributo alla coltura delle cellule. Professor Katriina albanese è riconosciuto per fornire il hiPSC linea utilizzata e BioMediTech Imaging Core facility per la fornitura di apparecchiature per l’imaging di fluorescenza.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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