Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.
Abstract
Hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs) zijn verantwoordelijk voor het continu vernieuwen het hoornvlies epithelium en dus behoud van hoornvlies homeostase en visuele helderheid. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide LESCs bieden een veelbelovende cel bron voor hoornvlies cel substitutietherapie. Ongedefinieerde, XENOGENECELLEN cultuur en differentiatie voorwaarden variatie veroorzaken in de onderzoeksresultaten en de klinische vertaling van hPSC afkomstige therapeutics belemmeren. Dit protocol biedt een reproduceerbare en efficiënte methode voor hPSC-LESC differentiatie xeno- en voorwaarden feeder cel-vrij. Ten eerste serveert enkelgelaagde cultuur van ongedifferentieerde hPSC op recombinante laminin-521 (LN-521) en gedefinieerde hPSC medium als een fundament voor de robuuste productie van kwalitatief hoogwaardige grondstof voor differentiaties. In de tweede plaats levert een snelle en eenvoudige hPSC-LESC differentiatie methode LESC populaties in slechts 24 dagen. Deze methode omvat een vierdaags oppervlakte ectodermal inductie in suspensie met kleine molecules, gevolgd door aanhangend cultuur fase op LN-521/collageen IV combinatie matrix in gedefinieerde hoornvlies epitheliale differentiatie medium. Cryostoring en uitgebreide differentiatie verder zuivert de celpopulatie en kunt bankieren van de cellen in grote hoeveelheden voor cel therapie producten. De resulterende hoogwaardige hPSC-LESCs bieden een mogelijke nieuwe behandeling strategie voor hoornvlies oppervlakte wederopbouw voor de behandeling van de cel van de stam van de limbal deficiëntie (LSCD).
Introduction
Het transparante hoornvlies aan de oculaire oppervlakte kunt licht in te voeren van het netvlies en biedt de meeste refractieve vermogen van het oog. De buitenste laag, de gestratificeerde hoornvlies epitheel, wordt voortdurend geregenereerd door limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs). De LESCs bevinden zich in de basale laag van de limbal nissen in het corneoscleral junction1,2. LESCs geen specifieke en unieke markers, zodat hun identificatie een meer uitgebreide analyse van een aantal vermeende markeringen vereist. Epitheliale transcriptie factor p63, en met name N-terminaal afgeknotte transcript van de alpha isovorm van p63 (ΔNp63α), is voorgesteld als een relevante positieve LESC markeerdraad3,4. Asymmetrische verdeling van LESCs kan ze zelf vernieuwen, maar ook de productie van nakomelingen die centripetaal en anteriorly worden gemigreerd. Als de cellen vooruitgang richting het hoornvlies oppervlak ze geleidelijk verliezen hun stemness en ten slotte terminaal onderscheid maken naar oppervlakkige squamous cellen die voortdurend verloren gaan van het hoornvlies oppervlak.
Schade aan een van de lagen van het hoornvlies kan leiden tot ernstige visuele handicap, en hoornvlies gebreken zijn dus een van de belangrijkste oorzaken van zicht verlies wereldwijd. In de cel van de stam van de limbal-deficiëntie (LSCD), is de limbus vernietigd door ziekte of een trauma die tot conjunctivalization en troebelingen van het hoornvlies oppervlak en daaropvolgende verlies van visie5,6 leidt. Cel substitutietherapie met behulp van autologe of allogene limbal transplantaties biedt de strategie van een behandeling voor patiënten met LSCD4,,7,,8,9. Echter, oogsten van autologe transplantaten draagt een risico van complicaties voor het gezonde oog en donorweefsel is schaars. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), specifiek menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), kan dienen als een onbeperkte bron van klinisch relevante celtypen, met inbegrip van hoornvlies epitheliale cellen. Zodoende, hPSC afkomstige LESCs (hPSC-LESCs) vormen een aantrekkelijke nieuwe cel voor oogbeschadigingen en/of cel substitutietherapie.
Traditioneel, hebben zowel de ongedifferentieerde hPSC cultuur-methoden en de protocollen van de differentiatie te LESCs vertrouwd op het gebruik van niet-gedefinieerde feeder cellen, dierlijke sera, geconditioneerde media of vruchtwater membranen10,11, 12 , 13 , 14 , 15. onlangs, streven naar veiligere cel therapie producten de zoektocht naar meer gestandaardiseerde en xeno-vrije cultuur en differentiatie protocollen hebben gevraagd. Dientengevolge, zijn verschillende gedefinieerde en xeno-gratis methoden voor langetermijnkweek van ongedifferentieerde hPSCs nu verkrijgbare16,17,18. Als een continuüm, gestuurde differentiatie protocollen te vertrouwen op moleculaire signalen bij hPSCs aan hoornvlies epitheliale lot onlangs geweest geïntroduceerd19,20,21,22, 23. Nog veel van deze protocollen beide ongedefinieerde, feeder gebaseerd hPSCs gebruikt als materiaal of complexe, XENOGENECELLEN groeifactor cocktail voor differentiatie wordt gestart.
Het doel van dit protocol is bedoeld als een robuuste, geoptimaliseerde, xeno- en feeder-vrije hPSC cultuur methode en latere differentiatie naar hoornvlies LESCs. Enkelgelaagde cultuur van pluripotente hPSCs op laminin-521 (LN-521) matrix gedefinieerd, albumine-gratis hPSC medium (specifiek essentiële 8 Flex) kunt snelle productie van homogene grondstof voor differentiaties. Daarna een eenvoudige, de strategie van de differentiatie van de twee stappen begeleidt hPSCs naar oppervlakte ectodermal lot in suspensie, gevolgd door aanhangend differentiatie naar LESCs. Een waar > 65% ΔNp63α express-celpopulatie wordt verkregen binnen 24 dagen. Het protocol xeno – en feeder-free is getest met verschillende hPSC lijnen (zowel hESCs als hiPSCs), zonder dat er gelden voor de cel specifieke optimalisering van de lijn. De protocollen voor het weekend-vrije onderhoud, passaging, cryostoring en hPSC-LESC fenotypering hier beschreven inschakelen productie van grote hoeveelheden van kwalitatief hoogwaardige LESCs voor klinische of onderzoek doeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verwachte resultaat van dit protocol is de generatie van het succesvolle en robuuste van LESCs uit een enkele celsuspensie van FF hPSC binnen ongeveer 3,5 weken. Zoals hoornvlies epitheel oppervlakte ectoderm €29 ontwikkelt, wordt de eerste stap van het protocol bedoeld om sturing van hPSCs naar deze bloedlijn. Een korte 24u inductie met transformeren groeifactor bèta (TGF-β) antagonist SB-505124, en bFGF worden gebruikt voor het opwekken van ectodermale differentiatie, gevolgd door 48 h m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door de Academie van Finland (subsidie nummer 297886), het programma van de menselijke reserveonderdelen van Tekes, het Fins financiering agentschap voor technologie en innovatie, het Finse oog en weefsel Bank Foundation en de Finse Cultural Foundation. De auteurs bedanken het biomedische laboratorium technici Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt en Outi Heikkilä voor uitstekende technische bijstand en de bijdrage aan de celcultuur. Professor Katriina Aalto-Setälä is erkend voor het verstrekken van de gebruikte hiPSC-lijn en de BioMediTech Imaging Core faciliteit voor het verstrekken van uitrusting voor fluorescentie imaging.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
