Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen
Summary
Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.
Abstract
Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) sind verantwortlich für das Hornhaut-Epithel kontinuierlich erneuert und damit die Aufrechterhaltung Hornhaut Homöostase und visuelle Klarheit. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete LESCs bieten eine viel versprechende Zelle Quelle für Hornhaut Zellersatztherapie. Undefiniert, xenogene Kultur und Differenzierung Bedingungen verursachen Variation in Forschungsergebnisse und behindern die klinische Übersetzung hPSC abgeleitet Therapeutika. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für hPSC LESC Differenzierung unter Xeno und Feeder zellfreie Bedingungen. Erstens dient Monolayer Kultur der undifferenzierten hPSC auf rekombinante Laminin-521 (LN-521) und definierte hPSC Medium als Grundlage für stabile Produktion von qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Zweitens ergibt eine schnelle und einfache hPSC LESC Differenzierung Methode LESC Populationen in nur 24 Tagen. Diese Methode beinhaltet eine viertägige Oberfläche ektodermalen Induktion in der Schwebe mit kleinen Molekülen, gefolgt von anhaftenden Kultur Phase auf LN-521/Kollagen IV Kombination Matrix in definierten Hornhaut epithelialen Differenzierung Medium. Cryostoring und erweiterte Differenzierung weiter reinigt die Zellpopulation und Banken der Zellen in großen Mengen für Zelle Therapie Produkte ermöglicht. Die daraus resultierende qualitativ hochwertige hPSC-LESCs bieten eine potenzielle neue Behandlungsstrategie für Hornhaut Flächenrückführung, limbisches Stammzell-Mangel (LSCD) zu behandeln.
Introduction
Die durchsichtige Hornhaut an der Augenoberfläche ermöglicht Licht in die Netzhaut und die Mehrheit der Brechkraft des Auges. Die äußerste Schicht, die geschichtete Hornhaut-Epithel wird kontinuierlich vom limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) regeneriert. Die LESCs befinden sich in der basalen Schicht der limbischen Nischen an der Corneoscleral Kreuzung1,2. LESCs fehlen spezifische und einzigartige Marker, so dass ihre Identifikation eine umfassendere Analyse eines Satzes von vermeintlichen Marker erfordert. Epitheliale Transkription Faktor p63 und vor allem N-Terminal verkürzten Abschrift der alpha Isoform von p63 (ΔNp63α), wurde vorgeschlagen, als eine entsprechende positive LESC Marker3,4. Asymmetrische Teilung der LESCs ermöglicht es ihnen, selbst zu erneuern, sondern auch produzieren nachkommen, die centripetally und anterior zu migrieren. Wie die Zellen die Fortschritte in Richtung der Hornhautoberfläche sie allmählich verlieren ihre Stemness und schließlich unheilbar differenzieren zu oberflächlichen Plattenepithelzellen, die kontinuierlich von der Hornhautoberfläche verloren gehen.
Schäden die Hornhautschichten kann zu schweren Sehbehinderungen führen und Hornhaut Mängel sind somit eine der häufigsten Todesursachen weltweit Verlust der Sehkraft. Im limbischen Stammzell-Mangel (LSCD) ist der Limbus zerstört, durch Krankheit oder Trauma führt zu Conjunctivalization und getrübten der Hornhautoberfläche und folgenden Verlust von Vision5,6. Handy-Ersatz-Therapie mit autologen oder allogenen limbisches Transplantate bietet eine Behandlungsstrategie für Patienten mit LSCD4,7,8,9. Jedoch Ernte autologe Transplantate birgt ein Risiko von Komplikationen für das gesunde Auge und Spendergewebe ist Mangelware. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), spezifisch humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), kann als eine unbegrenzte Quelle von klinisch relevante Zelltypen, einschließlich der Hornhaut Epithelzellen dienen. HPSC abgeleitet LESCs (hPSC-LESCs) stellen daher eine attraktive neue Zelle Quelle für okuläre Zellersatztherapie.
Bisher haben die undifferenzierte hPSC Kulturmethoden und ihrer Differenzierung Protokolle zum LESCs über den Einsatz von undefinierten Feeder-Zellen, tierischen Seren, konditionierte Medien oder amniotic Membranen10,11, verlassen 12 , 13 , 14 , 15. vor kurzem Bemühungen in Richtung sicherer Zelle Therapie Produkte haben dazu veranlasst, die Suche nach mehr standardisierte und Xeno-freie Kultur und Differenzierung-Protokolle. Infolgedessen sind mehrere definierte und Xeno-freie Methoden für langfristige Kultur der undifferenzierten hPSCs jetzt handelsüblichen16,17,18. Als ein Kontinuum, gezielte Differenzierung, die Protokolle unter Berufung auf molekulare Signale zu hPSCs Hornhaut epithelialen Schicksal führen in letzter Zeit haben19,20,21,22eingeführt, 23. Doch verwendet viele dieser Protokolle entweder nicht definiert, Feeder-basierte hPSCs als ab Material oder komplexe, xenogene Wachstumsfaktor Cocktails zur Differenzierung.
Dieses Protokoll soll eine robuste, optimierte, Xeno bieten- und Feeder-freie hPSC Kultur-Methode und anschließende Differenzierung zu Hornhaut LESCs. Monolayer Kultur der pluripotenten hPSCs auf Laminin-521 (LN-521) Matrix in definierten, Albumin-freie hPSC Medium (speziell wichtig 8 Flex) ermöglicht schnelle Herstellung von homogenen Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Danach führt eine einfache zweistufige Differenzierungsstrategie hPSCs in Richtung Oberfläche ektodermalen Schicksal in der Schwebe, gefolgt von anhaftenden Differenzierung zu LESCs. Eine Zellpopulation wo express > 65 % ΔNp63α wird innerhalb von 24 Tagen gewonnen. Das Xeno und Feeder-frei-Protokoll wurde mit mehreren hPSC Linien (hESC und HiPSCs), ohne jede Anforderung für Zelle Linie gezielte Optimierung getestet. Die Protokolle für Wochenende-freie Wartung, Passagierung, Cryostoring und hPSC LESC Phänotypisierung hier beschriebenen ermöglichen die Produktion von Großserien von qualitativ hochwertigen LESCs für klinische oder wissenschaftliche Zwecke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche und robuste Generation der LESCs aus einer einzigen Zelle Aussetzung der FF hPSC innerhalb von ca. 3,5 Wochen. Hornhaut-Epithel von der Oberfläche Ektoderm29entwickelt, soll der erste Schritt des Protokolls Lenkung hPSCs gegenüber dieser Linie. Eine kurze 24 h Induktion mit Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Antagonist SB-505124 und bFGF werden verwendet, um ektodermalen Differenzierung, gefolgt von 48 h mesodermalen BMP-4 C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde unterstützt durch die Akademie von Finnland (Grant-Nummer 297886), das menschliche Ersatzteile-Programm von Tekes, Finnish Funding Agency für Technologie und Innovation, die finnische Augen- und Gewebe-Bank-Stiftung und der finnischen Kulturstiftung. Die Autoren danken die biomedizinischen Laboranten Outi Melin, Hanna Pekkanen und Emma Vikstedt Outi Heikkilä für hervorragende technische Unterstützung und Beitrag zur Zellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä ist anerkannt für die Bereitstellung der HiPSC Linie verwendet und BioMediTech Imaging Core Facility für die Bereitstellung von Ausrüstung für die Fluoreszenz-Bildgebung.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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