יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה שני שלבים המבדילים הקרנית תאי גזע limbal אפיתל מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים ללא תא תרבות קסנו – ולא מזין. השיטות התרבות התא המוצג כאן מאפשרים חסכוניים, בקנה מידה גדול ייצור תאי איכות קליניים, החלים על שימוש טיפול תאי הקרנית.
Abstract
קרנית limbal אפיתל תאי גזע (LESCs) אחראים באופן רציף חידוש האפיתל הקרנית, ובכך שמירה על הומאוסטזיס הקרנית ואת בהירות חזותית. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר LESCs מספקים מקור תא מבטיח עבור טיפול בתחליפי תא הקרנית. לא מוגדר, xenogeneic תרבות ובידול תנאים לגרום וריאציה של תוצאות המחקר, לעכב את התרגום קליני של הרפוי נגזר hPSC. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה הדירים בידול hPSC-LESC בתנאים קסנו – ולא מזין נטול תאים. ראשית, טפט התרבות של hPSC מובחן laminin רקומביננטי-521 (LN-521) ו hPSC מוגדר בינוני משמש בסיס לייצור חומר המוצא באיכות גבוהה differentiations חזקים. שנית, שיטה בידול hPSC-LESC מהירה ופשוטה התשואות אוכלוסיות LESC ב- 24 יום בלבד. שיטה זו כוללת ארבעה ימים אינדוקציה ectodermal משטח ההשעיה עם מולקולות קטנות, ואחריו שלב חסיד התרבות על הרביעי LN-521/קולגן מטריקס שילוב במדיום מוגדר בידול אפיתל הקרנית. Cryostoring ובידול מורחב נוסף מטהרת את האוכלוסייה תא ומאפשר הבנקאות של התאים בכמויות גדולות עבור מוצרי טיפול תא. באיכות גבוהה וכתוצאה מכך hPSC-LESCs מספקים פוטנציאל טיפול חדשניים אסטרטגיה שיקום פני הקרנית לטפל מחסור בתאי גזע limbal (LSCD).
Introduction
הקרנית שקופה בפני השטח עינית מאפשר לאור להיכנס הרשתית ומספק את רוב כוח השבירה של העין. השכבה החיצונית ביותר, האפיתל הקרנית מרובדת, נוצר מחדש ללא הרף על ידי תאי גזע אפיתל limbal (LESCs). LESCs שוכנים לשכבת הבסיס של גומחות limbal ב corneoscleral צומת1,2. LESCs אין סמנים ייחודיים, אז את הזיהוי שלהם מחייב ניתוח מקיף יותר של ערכת סמנים בשם. P63 פקטור שעתוק אפיתל, במיוחד N-סופני קטום תעתיק איזופורם אלפא p63 (ΔNp63α), הוצע כפי רלוונטי חיובי LESC סמן3,4. חלוקה סימטרית של LESCs מאפשר להם לחדש את עצמי, אבל גם לייצר רומא זה להעביר את centripetally ואת anteriorly. כמו התאים התקדמות לעבר פני הקרנית הם בהדרגה לאבד את stemness שלהם, סוף סוף סופני להבדיל לתאים קשקשיים שטחית אובדות ברציפות ממשטח הקרנית.
נזק לאף אחד הרבדים קרניות יכולה להוביל לקות ראייה חמור, פגמים הקרנית ולפיכך הם אחד הגורמים המובילים של אובדן ראייה ברחבי העולם. במחסור בתאי גזע limbal (LSCD), לימבוס מושמד על ידי מחלה או טראומה מה שמוביל conjunctivalization ו- opacification של פני הקרנית ואובדן עוקבות של חזון5,6. תא החלפת טיפול באמצעות שתלים limbal עצמיים או allogeneic מציע אסטרטגיה לטיפול בחולים עם LSCD4,7,8,9. עם זאת, קצירת שתלים עצמיים נושא סיכון לסיבוכים בעין בריא, רקמה היא מחסור. האדם גזע pluripotent (hPSCs), במיוחד תאי גזע עובריים (hESCs) ואת האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), יכול לשמש כמקור בלתי מוגבל של סוגי תאים הרלוונטית קלינית, כולל תאים אפיתל הקרנית. לכן, נגזר hPSC LESCs (hPSC-LESCs) מייצגות מקור תא חדש אטרקטיבי לטיפול החלפת עינית התא.
באופן מסורתי, השיטות תרבות hPSC מובחן והן לפרוטוקולים שלהם בידול LESCs צריכים לסמוך על השימוש של תאים מזין לא מוגדר, סרה בעלי חיים, מדיה ממוזגים או קרום מי השפיר10,11, 12 , 13 , 14 , 15. לאחרונה, מאמצים לכיוון בטוח יותר מוצרי טיפול תא עוררו החיפוש אחר מספר מתוקנן ונטולת קסנו תרבות ובידול פרוטוקולים. כתוצאה מכך, מספר שיטות התרבות ארוכת טווח של hPSCs מובחן מוגדר ונטולת קסנו נמצאים כעת זמינים מסחרית16,17,18. כמו רצף, התמיינות מכוונת פרוטוקולים להסתמך על רמזים מולקולרית להנחות hPSCs הגורל אפיתל הקרנית היה לאחרונה הציג19,20,21,22, 23. עדיין רבים של פרוטוקולים אלה משמש גם hPSCs מזין המבוסס לא מוגדר, החל חומר, או מורכבים, xenogeneic פקטורי גדילה קוקטיילים על בידול.
המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק חזקות, אופטימיזציה, קסנו-שיטת תרבות נטולת מזין hPSC ואת בידול עוקבות LESCs הקרנית. טפט תרבות של pluripotent hPSCs-laminin-521 מטריקס (LN-521) במדיום מוגדר, אלבומין ללא hPSC (במיוחד חיוני 8 Flex) מאפשר ייצור מהיר של חומר המוצא הומוגנית differentiations. לאחר מכן פשוט, אסטרטגיית בידול שני שלבים מנחה hPSCs לכיוון פני השטח ectodermal הגורל ההשעיה, ואחריו חסיד בידול כדי LESCs. אוכלוסיה התא שבו > 65% לבטא ΔNp63α מתקבל בתוך 24 ימים. פרוטוקול קסנו-מזין נטול נבדקו עם מספר קווי hPSC (hESCs וגם hiPSCs), ללא מקפידים על תא קו מסוים אופטימיזציה. הפרוטוקולים עבור סוף השבוע ללא תחזוקה, passaging, cryostoring, hPSC-LESC phenotyping המתוארים כאן לאפשר ייצור של קבוצות גדולות של LESCs באיכות גבוהה עבור קליני או למטרות מחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאה הצפויה של פרוטוקול זה הוא מוצלח וחזק הדור של LESCs של השעיה תא בודד של FF hPSC בתוך כ- 3.5 שבועות. ככל אפיתל הקרנית מתפתח מן השטח האאקטודרם29, השלב הראשון של הפרוטוקול שמטרתה היגוי hPSCs לכיוון הזה השושלת. אינדוקציה קצר 24 שעות ביממה עם הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β) אנטגוניסט SB-505124, bFGF מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד (מענק מס ‘ 297886), התוכנית חלקי חילוף של Tekes, הסוכנות קרנות פינית עבור טכנולוגיה וחדשנות, העין פינית, קרן בנק רקמות, קרן התרבות הפינית. המחברים תודה את טכנאי מעבדות ביו Outi Melin, חנה Pekkanen, אמה Vikstedt ו- Outi Heikkilä עבור תרומה תרבית תאים וסיוע טכני מעולה. פרופסור Katriina אלטו-Setälä הוא הודה למתן להשתמש hiPSC קו של BioMediTech הדמיה הליבה מתקן לאספקת ציוד הדמיה זריחה.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
