ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出
Summary
ミツバチの脳の異なる領域におけるホスホリパーゼ C (PLC) 薬理学的薬剤の抑制効果をテストするためこれらの地域で PLC 活性を測定する生化学的アッセイを提案する.この試金は PLC 活動組織の中でだけでなく、さまざまな動作を示すミツバチの間での比較に役に立つかもしれません。
Abstract
ミツバチは、複雑な行動や学習、メモリ、および分業化などの高次脳機能を評価するためのモデル生物です。きのこ体 (MB) は、複雑なミツバチの行動の神経基盤をことを提案する高次脳センターです。以前の研究では、MBs と他の頭脳領域に発現する蛋白質および遺伝子を特定が各地域の蛋白質の活動はまだよくわかっていません。頭脳のこれらの蛋白質の機能を明らかにする薬理学的解析が可能なアプローチでは、薬理学的操作が実際にこれらの脳部位でのタンパク質の活性を変更を確認するの先決です。
我々 は以前ホスホリパーゼ C (PLC) 他の頭脳領域よりも MBs の遺伝子の高発現を識別され、薬理学的ミツバチ動作における PLC の関与を評価しました。その研究では、我々 は生化学的 2 薬理学的薬剤をテストし、彼らが MBs と他の頭脳領域における PLC 活性を減少したことを確認します。ミツバチ脳ホモジネートの PLC 活性を検出する方法の詳細な説明を紹介します。このアッセイ系で異なる脳の領域から派生した乳剤の合成蛍光基質と反応していると PLC 活動から生じる蛍光の定量化し脳部位間で比較しました。また同じシステムを使用して PLC 動作の特定の薬の抑制効果の評価について述べる。このシステムは、他の内因性蛍光化合物および/またはアッセイ コンポーネント及び組織の吸光度によって影響を受ける可能性がありますは、このシステムを使用して PLC 活性の測定は従来の試金を使用してより安全で簡単、標識基板が必要です。簡単な手順と操作 PLC 活性脳と異なる社会的課題に関わるミツバチの他の組織を調べることができます。
Introduction
ヨーロッパのミツバチ (セイヨウミツバチl.) は社会性昆虫と女性の蜂カースト依存再現と年齢依存した分業を表示します。たとえば、’workers’ と呼ばれる蜂の生殖不能のカーストでは、若い個人フィード成鳥古い飼料花の蜜と花粉ハイブ1外中。学習・記憶能力は、ミツバチの生活の中で非常に重要なので、採餌する必要があります食料源と巣の間行ったり来たり繰り返し行い、その後ダンスを通じてその nestmates を良い食料源の場所コミュニケーション1。以前の研究は、MB、昆虫、高次脳中枢がミツバチ2,3,4の学習・記憶能力に関与していることを示した。ミツバチ5,6,7,8,9,10 の様々 な脳領域における特異的発現遺伝子やタンパク質を識別されています。、11、彼らが脳の各領域のユニークな機能に関連が示唆されました。薬理学的抑制や興味の蛋白質の活性化ミツバチ行動12,13,14で蛋白質の機能を明らかにするためよく使用される方法ですが、すべてが医薬品かどうか知られているそれはないです。ミツバチの脳の異なる領域に機能への影響があります。このような薬物の機能の検証を強化する行動薬理学の研究の結論。
ここでは、我々 は PLC マウス認知15,16,17,18に関与する酵素の一つに焦点を当てます。PLC は、イノシトール三リン酸 1,4,5-(IP3) とジアシルグリセ ロール (DAG)19,20,21にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) を分解によるカルシウム シグナル伝達をトリガーします。IP3 IP3受容体の小胞体 (ER)、小胞体からのカルシウム イオンの放出につながるが開きます。リリースされたカルシウムは、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) カルモジュリンとプロテインキナーゼ C (PKC) DAG の存在下でアクティブにします。両方の蛋白質キナーゼ学習とメモリ22,23, PLC の関与がこのプロセスに一貫して関与しています。Plc は、PLCβ、PLCγ、PLCε、20代の構造に基づいてなどのサブタイプに分類されます。各 PLC サブタイプが20の別のコンテキストでは、アクティブ化され、さまざまな組織にそれらのサブタイプ遺伝子発現します。我々 は以前ミツバチ MBs が残りの脳領域24より高いレベルで PLCβ と PLCε のサブタイプをコードする遺伝子を表現し、2 つパン PLC 阻害剤 (edelfosine とネオマイシン硫酸 [ネオマイシン]) が PLC 活性を減少させることを実証異なる脳の領域と、確かに、ミツバチの24の学習・記憶能力に影響します。
伝統的にを使用して標識 PIP225、適切な訓練、機材、および設備を必要とする PLC の酵素活性を測定しました。合成蛍光基板 PLC の近年、確立された26, PLC 標準研究室の活動を評価するために簡単です。ここでは、蛍光基板を用いたミツバチの異なる脳の領域で PLC アクティビティを検出し、その後これらの組織で PLC edelfosine とネオマイシンの抑制効果をテストするための詳しいプロトコルを提案する.プロトコルは、基本的な操作のみを必要とするため他の組織における PLC 活動または社会の異なるタスクに割り当てられているミツバチの脳領域の研究に適用があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質の活性の生化学検査が深く重要な酵素の活動は基質と阻害剤などの様々 な分子に影響、一緒に変更できます、したがって、ので、脳内分子シグナリングを理解するため動物の行動 (例えば、学習およびメモリ)5。ミツバチの研究で酵素アデニル酸シクラーゼやリン酸化 CaMKII PKC サイクリック GMP 依存性プロテインキナーゼ サイクリック AMP 依存プロテインキ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図 4B – 4 D Suenamiらから変更されました。24生物学オープンの権限を持つ。著者は、アクセス許可のパブリッシャーに感謝しています。この作品は、ショタ Suenami し亮宮崎人間のフロンティア科学プログラム (RGY0077/2016) によって支えられました。
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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