Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti
Summary
Bal arısı beyin farklı bölgelerinde farmakolojik ajanların inhibitör etkileri Fosfolifaz C (PLC) üzerinde test etmek için biz bu bölgelerde PLC etkinliği ölçmek için biyokimyasal bir tahlil mevcut. Bu tahlil PLC etkinlik dokular arasında hem de farklı davranışlar sergileyen arılar arasında karşılaştırmak için yararlı olabilir.
Abstract
Balarısı karmaşık davranış ve öğrenme, bellek ve iş bölümü gibi daha yüksek beyin fonksiyonları değerlendirmek için bir model organizmadır. Mantar (MB) daha yüksek bir beyin merkezi sinir substrat karmaşık bal arısı davranışların olmak için önerilen organıdır. Genler ve proteinler differentially MBs ve diğer beyin bölgeleri ifade önceki çalışmalarda tespit rağmen her bölgedeki proteinlerin faaliyetleri henüz tam olarak anlaşılır değil. Bu proteinler beyin fonksiyonları ortaya çıkarmak için farmakolojik analizidir uygun bir yaklaşım farmakolojik manipülasyonlar gerçekten bu beyin bölgeleri protein etkinliğinde alter onaylamak için ilk gerekli değildir
Biz daha önce Fosfolifaz C (PLC) MBs diğer beyin bölgeleri içinde kodlama genlerin daha yüksek bir ifade tanımlanmış ve farmakolojik PLC katılımı bal arısı davranış değerlendirildi. Bu çalışmada, biyokimyasal olarak iki farmakolojik ajanlar test ve PLC MBs ve diğer beyin bölgeleri etkinliğinde azalma doğruladı. Burada, bal arısı beyin homogenate PLC bir etkinlik tespit nasıl ayrıntılı bir açıklama mevcut. Bu tahlil sistemdeki farklı beyin bölgelerden elde edilen homogenates sentetik fluorogenic substrat ile tepki ve PLC aktivitesinden kaynaklanan floresans sayılabilir ve beyin bölgeleri arasında karşılaştırıldığında. Ayrıca aynı sistemi kullanarak PLC faaliyete değerlendirmemizi bazı ilaçlar inhibitör etkilerinin açıklar. Bu sistem diğer endojen floresans bileşikler ve/veya tahlil bileşenleri ve dokuların absorbans tarafından etkilenen olasılığı olmasına rağmen bu sistemi kullanarak PLC etkinlik ölçümü daha güvenli ve bu geleneksel tahlil kullanarak daha kolay olan radiolabeled yüzeylerde gerektirir. Basit bir prosedür ve manipülasyonlar PLC aktivite beyni ve arıları farklı sosyal görevleri dahil diğer dokuların incelemek için bize izin verir.
Introduction
Avrupa bal arısı (Apis mellifera L.) eusocial böcek ve dişi arılar kast bağımlı üreme ve yaş bağımlı işbölümü göstermek. Örneğin, büyük olanlar yem nektar ve polen kovan1dışında iken ‘işçi’ olarak anılacaktır arılar steril kast içinde genç bireyler broods yem. Öğrenme ve hafıza toplayıcılar art arda gıda kaynakları ve onların yuva arasında ileri geri gidin ve onların nestmates dans aracılığıyla için iyi gıda kaynaklarının konumları iletişim kurmak çünkü bal arısı, hayatta önemli yeteneğidir iletişim1. Önceki çalışmalar MB, böcekler, daha yüksek bir beyin merkezinde bal arısı2,3,4öğrenme ve bellek yeteneği ilgilenmektedir gösterdi. Bal arısı5,6,7,8,9,10 , çeşitli beyin bölgelerinde differentially ifade genler ve proteinler tespit edilmiştir ,11her beyin bölgesi benzersiz işlevleri için ilişkili düşündüren,. Farmakolojik inhibisyon veya aktivasyon bir protein ilgi bal arısı davranış12,13,14proteinin işlevini ortaya çıkarmak için kullanılmış bir yaklaşım olmakla birlikte, bu olup tüm uyuşturucu bilinmiyor bal arısı beyin farklı bölgelerinde işlevsel etkileri vardır. Bu tür ilaçların fonksiyonların doğrulama çalışmaları sonuçlarını davranış Farmakoloji güçlendirecektir.
Burada, PLC, fare biliş15,da16,17,18karıştığı enzimler ele. PLC tarafından aşağılayıcı phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol (DAG)19,20,21sinyal kalsiyum tetikler. IP3 kalsiyum iyonları serbest bırakmak–dan ER önde gelen IP3 reseptörleri endoplazmik retikulum (ER), üzerinde açılır. Yayımlanan kalsiyum kalsiyum/calmodulin-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) ile calmodulin ve protein kinaz C (PKC) huzurunda DAG’ı etkinleştirir. Her iki protein kinaz öğrenme ve bellek22,23, PLC tutulumu bu süreçte tutarlı katılmaktadırlar. PLC’ler içine alt türlerinden, PLCβ, PLCγ ve PLCε, onların yapıları20tarihinde dayalı gibi kategorize edilir. Her PLC alt türü farklı bir bağlamda20dakikaya etkinleştirilir ve bu alt türlerinden kodlama genler differentially farklı dokularda ifade edilir. Biz daha önce bal arısı MBs kalan beyin bölgeleri24daha yüksek düzeyde PLCβ ve PLCε alt türlerinden kodlama genler express ve iki pan-PLC inhibitörleri (edelfosine ve paromisin sülfat [paromisin]) PLC aktivitesinde azalma gösterdi farklı beyin bölgelerini ve gerçekten de, bal arısı24öğrenme ve bellek yeteneğini etkiler.
Geleneksel olarak, PLC enzimatik aktivite uygun eğitim, ekipman ve tesisleri gerektiren radiolabeled PIP225, kullanarak ölçülen. Son zamanlarda, PLC, sentetik fluorogenic substrat kurulan26Standart laboratuvar PLC etkinliğini değerlendirmek kolaylaştırır, olmuştur. Burada, detaylı bir protokol PLC faaliyet fluorogenic substrat kullanarak bal arısı, farklı beyin bölgelerinde tespit etmek ve daha sonra bu dokularda edelfosine ve paromisin PLC inhibitör etkilerini test etmek için mevcut. Protokol yalnızca temel işlemler gerektirdiğinden, PLC aktivite diğer dokularda veya farklı sosyal görevler için ayrılan arılar beyin alanlarında çalışmaları için geçerli olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir enzim aktivitesinin yüzeylerde ve inhibitörleri, gibi çeşitli moleküller tarafından etkilenen ve böylece, ile birlikte değiştirebilirsiniz çünkü moleküler beyin, sinyal anlamak için son derece önemli protein faaliyet biyokimyasal incelenmesidir hayvan davranışları5(Örneğin, öğrenme ve hafıza). Bal arısı çalışmalarda, siklik AMP bağımlı protein kinaz A, siklik GMP-bağımlı protein kinaz, PKC, fosforile CaMKII ve adenilat cyclase gibi enzimler differenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şekil 4B – 4 D Suenami ve ark. güncellenmiştir 24 biyoloji açık izni ile. Yazarlar için yayımcı izni için minnettarız. Bu eser insan sınır bilim programı (RGY0077/2016) Shota Suenami ve Ryo Miyazaki tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
