Détection de l’activité de la Phospholipase C dans l’homogénat de cerveau de l’abeille
Summary
Pour tester les effets inhibiteurs des agents pharmacologiques sur la phospholipase C (PLC) dans différentes régions du cerveau de l’abeille, nous présentons une analyse biochimique pour mesurer l’activité du PLC dans ces régions. Cet essai pourrait être utile pour comparer l’activité PLC entre les tissus, ainsi que chez les abeilles présentant des comportements différents.
Abstract
L’abeille est un organisme modèle pour l’évaluation des comportements complexes et des fonctions cérébrales supérieures, telles que l’apprentissage, la mémoire et la division du travail. Le corps du champignon (MB) est un centre de cerveau supérieur a proposé d’être le substrat neuronal de comportements complexes abeille. Bien que les études antérieures identifié des gènes et protéines différentiellement exprimés dans la ROM et des autres régions du cerveau, l’activité des protéines dans chaque région n’est pas encore pleinement comprise. Pour révéler les fonctions de ces protéines dans le cerveau, analyse pharmacologique est une approche possible, mais il faut d’abord confirmer que des manipulations pharmacologiques modifient en effet l’activité de la protéine dans ces régions du cerveau.
Nous identifié précédemment une expression plus élevée des gènes codant la phospholipase C (PLC) en les MBs que dans d’autres régions du cerveau et évalués sur le plan pharmacologique l’implication du PLC dans le comportement des abeilles. Dans cette étude, nous avons biochimiquement testé deux agents pharmacologiques et confirmé qu’elles ont baissé d’activité PLC dans la ROM et des autres régions du cerveau. Nous présentons ici une description détaillée de la façon de détecter l’activité PLC dans l’homogénat de cerveau des abeilles. Dans ce système de dosage, homogénats provenant de différentes régions du cerveau sont réagit avec un substrat fluorogène synthétique, et fluorescence provenant des activités PLC est quantifiée et une comparaison entre les régions du cerveau. Nous décrivons également notre évaluation des effets de certains médicaments inhibiteurs sur l’activité PLC en utilisant le même système. Bien que ce système est probablement affectée par les autres composés endogènes fluorescence et/ou l’absorption des éléments d’analyse et des tissus, la mesure de l’activité PLC à l’aide de ce système est plus sûr et plus facile que celui utilisant l’analyse traditionnelle, qui nécessite des substrats. La procédure simple et manipulations permettent d’examiner l’activité PLC dans le cerveau et d’autres tissus des abeilles en participant à différentes tâches sociales.
Introduction
L’abeille européenne (Apis mellifera L.) est un insecte eusocial, et les abeilles femelles Voir la reproduction de caste-dépendante et fonction de l’âge de division du travail. Par exemple, dans la caste stérile des abeilles dénommé « travailleurs », des individus plus jeunes nourrissent les couvées tandis que les plus âgés fourrage de nectar et pollen à l’extérieur de la ruche1. Apprentissage et la mémoire capacité est extrêmement importante dans la vie de l’abeille, parce que les butineuses doivent à plusieurs reprises, aller et venir entre les sources de nourriture et de leur nid et puis communiquer les emplacements des bonnes sources alimentaires à leurs congénères par le biais de danse communication1. Des études antérieures ont démontré que le MB, un centre du cerveau plus élevé chez les insectes, est impliqué dans la capacité d’apprentissage et la mémoire des abeilles2,3,4. Expression différentielle des gènes et des protéines ont été identifiées dans les différentes régions du cerveau de l’abeille5,6,7,8,9,10 ,11, ce qui suggère qu’elles sont liées aux fonctions uniques de chaque région du cerveau. Bien que l’inhibition pharmacologique ou l’activation d’une protéine d’intérêt est une approche très utilisée pour révéler la fonction de la protéine à l’abeille comportement12,13,14, on ne sait pas si tous les médicaments ont des effets fonctionnels dans différentes régions du cerveau de l’abeille. La validation des fonctions de ces drogues renforcera les conclusions dans les études de pharmacologie comportementale.
Ici, nous nous concentrons sur PLC, l’un des enzymes impliqués dans la cognition de souris15,16,17,18. PLC déclencheurs calcium signalisation par dégradants phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) dans l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 ouvre IP3 récepteurs sur le réticulum endoplasmique (re), aboutissant à la libération des ions de calcium de l’ER. Le calcium libéré active fois calcium/calmoduline-dépendante de protéine-kinase II (CaMKII) avec la calmoduline et la protéine kinase C (PKC) en présence de DAG. Les deux protéines kinases sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire22,23, compatibles avec l’implication de PLC dans ce processus. Automates programmables sont catégorisés en sous-types, y compris la PLCβ, PLCγ et PLCε, basée sur leurs structures20. Chaque sous-type PLC intervient dans un contexte différent de20, et des gènes codant ces sous-types sont exprimés différentiellement dans différents tissus. Nous avons démontré précédemment qu’abeilles MBs expriment des gènes codant pour des sous-types PLCβ et PLCε à des niveaux plus élevés que le reste des régions cérébrales24, et que deux inhibiteurs de la pan-PLC (édelfosine et néomycine sulfate [néomycine]) diminuent l’activité PLC dans différentes régions du cerveau et, en effet, affecter la capacité d’apprentissage et la mémoire des abeilles24.
Traditionnellement, l’activité enzymatique de PLC a été mesurée selon radiomarquées PIP225, qui nécessite des installations, l’équipement et une formation appropriée. Récemment, un substrat fluorogène synthétique de PLC a été établie26, rendant facile évaluer l’activité PLC en laboratoire standard. Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter l’activité PLC dans différentes régions du cerveau de l’abeille en utilisant le substrat fluorogène et ensuite tester les effets inhibiteurs de l’édelfosine et la néomycine sur PLC dans ces tissus. Parce que le protocole nécessite des manipulations de base seulement, elle peut être applicable aux études de l’activité PLC dans d’autres tissus ou zones du cerveau chez les abeilles affectées à des tâches sociales différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’examen biochimique de l’activité de la protéine est profondément important pour comprendre la signalisation moléculaire dans le cerveau, parce que l’activité d’une enzyme est affectée par diverses molécules, comme substrats et inhibiteurs et peut, ainsi, passer le long d’avec comportement animal (p. ex., apprentissage et mémoire)5. Dans les études de l’abeille, enzymes comme dépendante de l’AMP cyclique protéine kinase A, protéine kinase dépendante du GMP cycl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figure 4 b – 4D a été modifiée de Suenami et al. 24 avec la permission de biologie ouvert. Les auteurs sont reconnaissants à l’éditeur pour l’autorisation. Ce travail a été soutenu par le Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) à Shota Suenami et Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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