זיהוי של Phospholipase C פעילות Homogenate המוח של דבורת הדבש
Summary
כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של סוכנים תרופתי על phospholipase C (PLC) באזורים שונים של המוח הונאיבי, נציג של assay ביוכימי כדי למדוד PLC פעילות באזורים אלה. Assay זה יכול להיות שימושי לצורך השוואת פעילות PLC בין רקמות, כמו גם בין דבורים מפגין התנהגויות שונות.
Abstract
דבורת הדבש היא אורגניזם מודל להערכת התנהגויות מורכבות ותפקוד המוח גבוה יותר, כגון למידה, זיכרון, חלוקת עבודה. הגוף פטריות (MB) הוא מרכז המוח גבוה יותר הציע להיות המצע עצבית של התנהגויות מורכבות דבורת הדבש. למרות שמחקרים קודמים לזיהוי גנים וחלבונים אשר באה לידי ביטוי באופן שונה את MBs, באזורים אחרים במוח, הפעילות של החלבונים בכל אזור אינם עדיין לגמרי מובנים. כדי לחשוף את הפונקציות של חלבונים אלו במוח, ניתוח תרופתי היא גישה אפשרית, אבל זה הכרחי הראשון כדי לאשר כי מניפולציות תרופתי אכן לשנות את פעילות החלבון באזורים האלה במוח.
אנו זוהו בעבר ביטוי גבוה יותר של גנים קידוד phospholipase C (PLC) ב- MBs מאשר באזורים אחרים במוח, פרמקולוגית העריכו את מעורבותם של בקר לוגי מיתכנת בהתנהגות דבורת הדבש. במחקר הזה, אנחנו מבחינה ביוכימית נבדקו שני סוכנים תרופתי ולא אישרו כי הם ירדו PLC פעילות ב- MBs ואזורים אחרים במוח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של איך לזהות פעילות PLC הונאיבי המוח homogenate. במערכת זו assay, homogenates נגזר אזורי מוח שונים הם הגיבו עם מצע fluorogenic סינתטי, זריחה כתוצאה מפעילות PLC לכמת, בהשוואה בין אזורי המוח. גם נתאר את ההערכות שלנו מעכבות ההשפעות של תרופות מסוימות על פעילות PLC באמצעות אותה שיטה. למרות מערכת זו סביר מושפע תרכובות אחרות פלורסצנטיות אנדוגני ו/או את ספיגת של רכיבים assay ורקמות, המדידה של בקר לוגי מיתכנת פעילות באמצעות מערכת זו הוא יותר קל מאשר כי שימוש מסורתי וזמינותו, אשר דורש radiolabeled סובסטרטים. הליך פשוט ואת המניפולציות מאפשר לבחון PLC פעילות המוח ורקמות אחרות של דבורי הדבש מעורב פעילויות חברתיות שונות.
Introduction
דבורת הדבש האירופית (בומבוס ל’) הוא חרק eusocial, דבורים הנשי להראות תלויי-קאסטה רבייה תלויי-גיל חלוקת עבודה. לדוגמה, בקאסטה סטרילי דבורים המכונה ‘עובדים’, אנשים צעירים להאכיל את האפרוחים ואילו המבוגרים יותר מספוא צוף ואבקה בחוץ הכוורת1. למידה וזיכרון היכולת היא ללא ספק חשובה בחייו של דבורת הדבש, כי איוראו עליו שוב ושוב הולכות הלוך ושוב בין מקורות המזון ואת הקן שלהם, ואז לתקשר את המיקומים של מקורות מזון טוב כדי nestmates שלהם דרך הריקוד תקשורת1. מחקרים קודמים הראו כי מגה, מרכז המוח גבוה יותר חרקים, מעורב יכולת למידה וזיכרון של דבורת דבש2,3,4. באופן שונה ביטוי גנים, חלבונים זוהו אזורים שונים במוח של דבורת דבש5,6,7,8,9,10 ,11, רומז כי הן קשורות פונקציות ייחודיות של כל אזור במוח. למרות עיכוב תרופתי או הפעלה של חלבון עניין בגישה המשומשת כדי לחשוף את תפקוד החלבון של דבורת הדבש התנהגות12,13,14, זה לא ידוע כל תרופות יש תופעות פונקציונלי באזורים שונים של המוח דבורת הדבש. האימות של הפונקציות של תרופות מסוג זה יחזק מסקנות מחקרים התנהגותיים פרמקולוגיה.
כאן, אנו מתמקדים PLC, אחד של אנזימים בהפרות העכבר קוגניציה15,16,17,18. בקר לוגי מיתכנת מפעיל סידן איתות על ידי משפילים phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) לתוך אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP3) ו- diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 נפתח IP3 רצפטורים על תוך-פלזמית (ER), מוביל שחרור של יוני הסידן מחדר המיון. הסידן שפורסמו מפעיל קינאז החלבון קלמודולין-סידן/תלויי II (CaMKII) עם קלמודולין וגם חלבון קינאז C (PKC) בנוכחות דאג. שני חלבונים kinases מעורבים לימוד, זיכרון22,23, עקבי עם המעורבות של בקר לוגי מיתכנת בתהליך זה. בקרים מתוכנתים מסווגים לתוך תת, כולל PLCβ, PLCγ PLCε, בהתבסס על מבנים שלהם20. כל סוג של בקר לוגי מיתכנת מופעלת ב- הקשר שונה20, גנים קידוד יחוברו אלה מתבטאים באופן שונה ברקמות שונות. אנחנו הפגינו בעבר כי הונאיבי MBs גנים קידוד תת PLCβ ו- PLCε ברמות גבוהות יותר מאשר האזורים הנותרים המוח24ו פאן-PLC שני מעכבי (edelfosine ו- neomycin סולפט [neomycin]) להקטין את הפעילות בקר לוגי מיתכנת שונים במוח אזורים, ואכן, משפיעה על יכולתו למידה וזיכרון של דבורת הדבש24.
באופן מסורתי, הפעילות האנזימטית מתרחשת של בקר לוגי מיתכנת יש כבר נמדד באמצעות radiolabeled פיפ225, המחייב הכשרה מתאימה, ציוד ומתקנים. לאחרונה, מצע fluorogenic סינתטי של בקר לוגי מיתכנת כבר הוקמה26, ולכן קל להעריך PLC פעילות במעבדה רגילה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לאתר בקר לוגי מיתכנת פעילות באזורי מוח שונים מדבורת הדבש באמצעות המצע fluorogenic, ולאחר מכן לבחון את ההשפעה המעכבת של edelfosine ו neomycin על בקר לוגי מיתכנת ברקמות אלה. כי הפרוטוקול דורש רק בסיסי מניפולציות, ייתכן החלים על מחקרים של בקר לוגי מיתכנת פעילות ברקמות אחרות או המוח באזורים דבורים המוקצה לפעילויות חברתיות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחינה הביוכימי של פעילות החלבון חשוב עמוקות להבנת איתות מולקולרית במוח, כי הפעילות של אנזים מושפע מולקולות שונות, כגון מצעים, מעכבי, ולשנות, לפיכך, יחד עם התנהגות בעלי חיים (למשל, למידה וזיכרון)5. במחקרים הונאיבי, אנזימים כגון מחזורי AMP תלוית חלבון קינאז A, מחזורי GMP תלוית חל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
איור 4B – 4 D היה שונה. Suenami et al. 24 באישורו של ביולוגיה פתוח. המחברים מודים למפרסם את ההרשאה. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע לתוכנית (RGY0077/2016) שותא Suenami, ריו מיאזאקי.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
