Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape
Summary
Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell’ape mellifica, presentiamo un’analisi biochimica per misurare l’attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.
Abstract
L’ape è un organismo modello per la valutazione di comportamenti complessi e funzioni cerebrali superiori, come apprendimento, memoria e divisione del lavoro. Il corpo del fungo (MB) è un centro superiore di cervello proposto per essere il substrato neurale dei comportamenti complessi dell’ape mellifica. Sebbene studi precedenti identificati geni e proteine differenzialmente espressi in MBs e altre regioni del cervello, l’attività delle proteine in ogni regione non sono ancora pienamente compreso. Per rivelare le funzioni di queste proteine nel cervello, analisi farmacologica sono un approccio fattibile, ma è prima necessario confermare che le manipolazioni farmacologiche infatti alterano l’attività della proteina in queste regioni del cervello.
Abbiamo precedentemente identificato un’ più alta espressione di geni che codificano la fosfolipasi C (PLC) in MBs che in altre regioni del cervello e farmacologicamente valutato il coinvolgimento di PLC nel comportamento dell’ape mellifica. In quello studio, abbiamo biochimicamente testato due agenti farmacologici e confermato che hanno attività in diminuzione PLC in MBs e altre regioni del cervello. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di come rilevare attività PLC in omogeneato del cervello dell’ape mellifica. In questo sistema di dosaggio, omogeneati derivati dalle regioni differenti del cervello sono ha reagiti con un substrato fluorogenico sintetico e fluorescenza risultanti da attività PLC è quantificato e rispetto tra regioni del cervello. Inoltre descriviamo la nostra valutazione degli effetti inibitori di determinate droghe sulle attività del PLC utilizzando lo stesso sistema. Anche se questo sistema è probabilmente influenzata da altri composti endogeni fluorescenza e/o l’assorbanza dei tessuti e dei componenti di analisi, la misurazione dell’attività PLC utilizzando questo sistema è più sicuro e più facile che quello usando l’analisi tradizionale, che richiede substrati radioattivi. La procedura semplice e manipolazioni consentono di esaminare l’attività PLC nel cervello ed in altri tessuti delle API da miele coinvolti in diverse attività sociali.
Introduction
L’ape europea (Apis mellifera L.) è un insetto eusociali e API femminile mostrano una riproduzione casta-dipendente ed età-dipendente divisione del lavoro. Ad esempio, nella casta sterile delle API che si riferisce come “lavoratori”, i più giovani individui feed nidiate mentre quelli più vecchi foraggio nettare e polline fuori l’ alveare1. Apprendimento e memoria capacità è criticamente importante nella vita dell’ape, perché api bottinatrici devono ripetutamente ad andare avanti e indietro tra fonti alimentari e loro nido e quindi comunicare le posizioni delle origini di buon cibo ai loro membri ancora in vita attraverso la danza comunicazione1. Gli studi precedenti hanno dimostrato che il MB, un centro superiore di cervello negli insetti, è coinvolto nella capacità di apprendimento e la memoria del honeybee2,3,4. Proteine e geni differenzialmente espressi sono stati identificati in varie regioni del cervello del honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, suggerendo che sono collegate alle funzioni uniche di ogni regione del cervello. Sebbene l’inibizione farmacologica o l’attivazione di una proteina di interesse è un approccio ben utilizzato per rivelare la funzione della proteina dell’ape mellifica comportamento12,13,14, non si sa se tutti farmaci hanno effetti funzionali in diverse regioni del cervello dell’ape mellifica. La convalida delle funzioni di tali farmaci rafforzerà conclusioni negli studi di farmacologia comportamentale.
Qui, ci concentriamo su PLC, uno degli enzimi implicati in mouse cognizione15,16,17,18. PLC attiva segnalazione degradando fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) in inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG)19,20,21calcio. IP3 apre recettori di3 IP il reticolo endoplasmatico (ER), che conduce al rilascio di ioni calcio dall’ER. Il calcio rilasciato attiva sia calcio/calmodulina-dipendente della proteina chinasi II (CaMKII) con calmodulina e protein chinasi C (PKC) in presenza di DAG. Entrambi chinasi di proteina sono coinvolti nell’apprendimento e nella memoria22,23, coerente con il coinvolgimento di PLC in questo processo. PLC sono suddivisi in sottotipi, tra cui PLCβ, PLCγ e PLCε, basato sulle loro strutture20. Ogni sottotipo PLC viene attivato in un contesto diverso20e geni che codificano per tali sottotipi sono differenzialmente espressi in tessuti differenti. Precedentemente abbiamo dimostrato che honeybee MBs esprimono geni che codificano per sottotipi PLCβ e PLCε a livelli più alti del restante cervello regioni24, e che due inibitori di pan-PLC (edelfosine e neomicina solfato [neomicina]) diminuiscono PLC attività in differenti regioni del cervello e, infatti, influenzare la capacità di apprendimento e la memoria del honeybee24.
Tradizionalmente, l’attività enzimatica di PLC è stato misurato usando radiomarcato PIP225, che richiede strutture, attrezzature e formazione adeguata. Recentemente, un substrato fluorogenico sintetico di PLC è stato stabilito26, rendendo facile valutare l’attività PLC in laboratorio standard. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare l’attività PLC nelle regioni differenti del cervello dell’ape usando il substrato fluorogenic e successivamente testare gli effetti inibitori di edelfosine e neomicina su PLC in questi tessuti. Poiché il protocollo richiede solo manipolazioni di base, può essere applicabile agli studi di PLC attività in altri tessuti o aree del cervello nelle API assegnate ai diversi compiti sociali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’esame biochimico della attività della proteina è profondamente importante per comprendere la segnalazione molecolare nel cervello, perché l’attività di un enzima è influenzata da varie molecole, quali substrati e inibitori e può, quindi, cambiare lungo con comportamento animale (ad es., apprendimento e memoria)5. Negli studi dell’ape mellifica, enzimi come la chinasi AMP ciclico-dipendente della proteina A, protein-chinasi GMP ciclico-dipendente, PKC, CaMKII fosforilato e adenilat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figura 4B – 4D è stata modificata da Suenami et al. 24 con il permesso della biologia Open. Gli autori sono grati all’editore per l’autorizzazione. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) a Shota Suenami e Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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