Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij
Summary
Om te testen de remmende effecten van farmacologische agenten op phospholipase C (PLC) in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij, presenteren we een biochemische assay voor het meten van de PLC activiteit in die regio’s. Deze bepaling zou kunnen zijn handig voor het vergelijken van PLC activiteit onder weefsels, alsook tussen de bijen verschillende gedragingen vertonen.
Abstract
De honingbij is een modelorganisme voor het evalueren van complexe gedrag en hogere hersenfunctie, zoals leren, geheugen en verdeling van de arbeid. De paddestoel lichaam (MB) is een hogere hersenen centrum voorgesteld als de neurale substraat van complexe honingbij gedrag. Hoewel eerdere studies geïdentificeerd genen en proteïnen die differentieel op de MBs en andere hersengebieden worden uitgedrukt, zijn de activiteiten van de eiwitten in elke regio nog niet volledig begrepen. Om weer te geven van de functies van deze eiwitten in de hersenen, farmacologische analyse is een haalbare aanpak, maar is het eerst nodig om te bevestigen dat farmacologische manipulaties inderdaad veranderen als u de activiteit van het eiwit in deze hersengebieden.
Wij eerder een hogere uitdrukking van genen coderend voor phospholipase C (PLC’s) in de MBs dan in andere hersengebieden, en farmacologisch beoordeeld de betrokkenheid van PLC in het gedrag van de honingbij. In deze studie, wij biochemically twee farmacologische agenten getest en bevestigd dat ze PLC activiteit in de MBs en andere hersengebieden daalde. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van hoe te detecteren PLC activiteit in honingbij hersenen homogenaat. In dit systeem assay homogenates afgeleid van verschillende hersengebieden zijn reageerde met een synthetische fluorogenic substraat en fluorescentie die voortvloeien uit de activiteit van de PLC is gekwantificeerd en vergeleken tussen hersengebieden. Ook beschrijven we onze evaluatie van de remmende effecten van bepaalde drugs op de activiteit van de PLC met behulp van hetzelfde systeem. Hoewel dit systeem waarschijnlijk beïnvloed door andere endogene fluorescentie-verbindingen en/of de absorptie van de onderdelen van de test en de weefsels is, de meting van de activiteit van de PLC met behulp van dit systeem is veiliger en gemakkelijker dan dat het gebruik van de traditionele bepaling, die vereist radiolabeled substraten. De eenvoudige procedure en de manipulaties laten te onderzoeken PLC activiteit in de hersenen en andere weefsels van honingbijen die betrokken zijn bij verschillende sociale taken.
Introduction
De Europese honingbij (Apis mellifera L.) is een insect eusociale en vrouwelijke bijen Toon kaste-afhankelijke reproductie en leeftijd-afhankelijke verdeling van de arbeid. Bijvoorbeeld in de steriele kaste van bijen hierna aangeduid als “werknemers”, voedt jongere personen de broedsels, terwijl oudere nectar en pollen buiten de korf-1 voedergewassen. Leren en geheugen, vermogen is kritisch belangrijk in het leven van de honingbij, omdat foragers moet herhaaldelijk gaan heen en weer tussen voedselbronnen en hun nest en vervolgens de locaties van goed voedselbronnen aan hun nestmates door middel van dans communiceren mededeling1. Vorige studies aangetoond dat de MB, een hogere centrum van de hersenen bij insecten, bij de mogelijkheid van het leren en geheugen van de honingbij2,3,4 betrokken is. Differentially uitgedrukte genen en eiwitten zijn geïdentificeerd in verschillende hersengebieden van de honingbij5,6,7,8,9,10 ,11, suggereren dat ze gerelateerd zijn aan de unieke functies van elke regio van de hersenen. Hoewel de farmacologische remming of activering van een proteïne van belang een goed gebruikt aanpak is te onthullen van de functie van het eiwit in honingbij gedrag12,13,14, is het niet bekend of alle drugs functionele gevolgen hebben in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij. De validatie van de functies van dergelijke drugs zal versterken conclusies in studies van gedrags farmacologie.
Hier, richten we ons op PLC, één van de enzymen die betrokken zijn bij muis cognitie15,16,17,18. PLC triggers calcium signalering door vernederende phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) en diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP-3 opent IP-3 receptoren op het endoplasmatisch reticulum (ER), wat leidt tot de vrijlating van calciumionen uit de ER. Het vrijgegeven calcium activeert zowel calcium/Calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II (CaMKII) met Calmoduline en proteïne kinase, C (PKC) in aanwezigheid van de DAG. Beide kinases eiwitten zijn betrokken bij het leren en geheugen22,23, consistent met de betrokkenheid van PLC in dit proces. NV’s zijn onderverdeeld in subtypes, waaronder PLCβ, PLCγ en PLCε, op basis van hun structuren20. Elk subtype PLC is geactiveerd in een andere context20en genen coderend voor deze subtypen worden differentieel uitgedrukt in verschillende weefsels. Wij eerder aangetoond dat honingbij MBs express genen coderend voor PLCβ en PLCε subtypen op een hoger niveau dan de resterende hersenen regio’s24, en dat twee pan-PLC-remmers (edelfosine en neomycine sulfaat [neomycine]) afnemen PLC activiteit in verschillende regio’s brain en, inderdaad, invloed hebben op het leren en geheugen van de honingbij24.
Traditioneel, heeft de enzymatische activiteit van PLC is gemeten met behulp van radiolabeled PIP225, waarvoor passende opleiding, apparatuur en faciliteiten. Onlangs, een synthetische fluorogenic substraat van PLC geweest gevestigde26, waardoor het gemakkelijk is om te beoordelen PLC activiteit in het standaard laboratorium. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te detecteren PLC activiteit in verschillende hersengebieden van de honingbij met behulp van het substraat fluorogenic en vervolgens de remmende effecten van edelfosine en neomycine op PLC in deze weefsels te testen. Omdat het protocol alleen elementaire manipulaties vereist, kan zij toepassing op studies van PLC activiteiten in andere weefsels of hersengebieden in bijen toegewezen aan verschillende sociale taken worden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het biochemisch onderzoek van eiwit activiteit is uiterst belangrijk voor het begrip van de moleculaire signalering in de hersenen, omdat de activiteit van het enzym wordt beïnvloed door verschillende moleculen, zoals substraten en inhibitors, en dus mee kunt wijzigen dierlijk gedrag (b.v., leren en geheugen)5. In studies van de honingbij, worden enzymen zoals cyclisch AMP-afhankelijk proteïne kinase A, cyclisch GMP-afhankelijk proteïne kinase PKC, gefosforyleerd CaMKII en adenylaat cy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figuur 4B – 4 D werd van Suenami et al. gewijzigd 24 met toestemming van Open biologie. De auteurs zijn dankbaar aan de uitgever voor de machtiging. Dit werk werd gesteund door het Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami en Ryo Miyazaki.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
