الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل
Summary
لاختبار الآثار المثبطة لعوامل دوائية على phospholipase C (PLC) في مناطق مختلفة من الدماغ نحل العسل، نقدم مقايسة بيوكيميائية لقياس النشاط التشريعي في تلك المناطق. هذا التحليل يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة النشاط التشريعي بين الأنسجة، وكذلك بين النحل العارضة سلوكيات مختلفة.
Abstract
نحل العسل كائن نموذج لتقييم السلوكيات المعقدة وأعلى وظيفة المخ، مثل التعلم والذاكرة، وتقسيم العمل. الجسم الفطر (MB) مركز الدماغ أعلى واقترح أن تكون الركيزة العصبية من سلوكيات نحل العسل المعقدة. على الرغم من أن دراسات سابقة حددت الجينات والبروتينات التي يتم التعبير عنها متفاوتاً في MBs ومناطق أخرى في الدماغ، أنشطة البروتينات في كل منطقة لا بعد فهم فهما كاملا. للكشف عن وظائف هذه البروتينات في الدماغ، تحليل دوائية نهجاً عمليا، ولكن هو الضرورة الأولى لتأكيد أن التلاعب دوائية يغير الواقع نشاط البروتين في هذه المناطق في الدماغ.
ونحن سبق تحديد تعبير أعلى من الجينات ترميز phospholipase C (المجلس التشريعي) في MBs من مناطق أخرى من الدماغ، وتقييم عقاقيري إشراك المجلس التشريعي في سلوك نحل العسل. في هذه الدراسة، ونحن المتحلل اختبار العميلين دوائية وأكدت أنها انخفضت النشاط التشريعي في MBs ومناطق أخرى في الدماغ. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لكيفية الكشف عن النشاط التشريعي في نحل العسل هوموجيناتي الدماغ. في هذا النظام المقايسة، هي رد فعل homogenates المستمدة من مناطق الدماغ المختلفة مع الركازة فلوروجينيك اصطناعية، والأسفار الناتجة عن نشاط المجلس التشريعي هو كمياً ومقارنة بين مناطق الدماغ. كما يصف لنا تقييمنا لتأثيرات بعض العقاقير المثبطة في نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام نفس النظام. على الرغم من أن هذا النظام من المرجح المتأثرين بغيرها من المركبات الفلورية الذاتية و/أو امتصاص المكونات المقايسة والأنسجة، بقياس نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام هذا النظام أكثر أماناً وأسهل من استخدام هذا التحليل التقليدي، الذي يتطلب ركائز راديولابيليد. إجراء بسيط والتلاعبات تسمح لنا بدراسة النشاط التشريعي في العقول والأنسجة الأخرى للمشاركة في مختلف المهام الاجتماعية نحل العسل.
Introduction
نحل العسل (Apis mellifera L.) الأوروبية الحشرات eusocial، والنحل الإناث تظهر الطبقة الاجتماعية تعتمد على الاستنساخ والعمر-تعتمد على تقسيم العمل. على سبيل المثال، تغذية الأفراد الأصغر سنا في الطبقة العقيمة للنحل يشار إليها ‘العمال’، broods بينما الأكبر سنا الأعلاف الرحيق وحبوب اللقاح خارج الخلية1. التعلم والذاكرة القدرة ذات أهمية حاسمة في حياة نحل العسل، لأنه يجب أن مرارا وتكرارا الانتقال ذهابا وإيابا بين مصادر الغذاء والعش باحثات وثم الاتصال بمواقع مصادر غذائية جيدة لما نيستماتيس من خلال الرقص الاتصالات1. أظهرت الدراسات السابقة أن ميغابايت، مركزا أعلى للدماغ في الحشرات، متورطة في القدرة على التعلم والذاكرة لنحل العسل2،،من34. وقد حددت الأثران عن الجينات والبروتينات في مختلف مناطق الدماغ لنحل العسل5،6،،من78،9،10 ،11، مما يوحي بأنها ترتبط بوظائف فريدة من نوعها لكل منطقة الدماغ. رغم تثبيط دوائية أو تنشيط بروتين الاهتمام نهجاً جيدا المستخدمة للكشف عن وظيفة البروتين في نحل العسل السلوك12،،من1314، أنه لا يعرف ما إذا كانت جميع الأدوية أن الآثار الفنية في مناطق مختلفة من الدماغ نحل العسل. وستعزز التحقق المهام لهذه العقاقير الاستنتاجات في الدراسات السلوكية الصيدلة.
هنا، علينا أن نركز على المجلس التشريعي الفلسطيني، واحد من الإنزيمات المتورطين في الماوس الإدراك15،16،،من1718. المجلس التشريعي الفلسطيني يطلق الكالسيوم مما يشير إلى جانب المهينة فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) إلى اينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3) ودياسيلجليسيرول (همرشولد)19،،من2021. الملكية الفكرية3 يفتح IP3 مستقبلات في هيولى (ER)، مما يؤدي إلى الإفراج عن أيونات الكالسيوم لائحة. صدر الكالسيوم ينشط كيناز البروتين الكالسيوم/كالمودولين-تعتمد على الثاني (كامكي) مع كالمودولين والبروتين كيناز ج (PKC) حضور همرشولد. وتشارك كلا مؤنزم البروتين في التعلم والذاكرة22،23، اتساقا مع إشراك المجلس التشريعي في هذه العملية. وتصنف الشركات المحدودة العامة إلى الأنواع الفرعية، بما في ذلك PLCβ، PLCγ، و PLCε، استناداً إلى تلك الهياكل20. يتم تنشيط كل نوع فرعي المجلس التشريعي الفلسطيني في سياق مختلف20، والأثران يتم التعبير عن الجينات ترميز تلك المخططات في أنسجة مختلفة. أظهرنا سابقا أن نحل العسل MBs التعبير عن الجينات ترميز أنواع فرعية PLCβ و PLCε عند مستويات أعلى من مناطق الدماغ المتبقية24، وأن عموم-المجلس التشريعي الفلسطيني هما مثبطات (كبريتات اديلفوسيني والنيوميسين [النيوميسين]) انخفاض نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني في مختلف مناطق الدماغ، وفي الواقع، تؤثر على القدرة على التعلم والذاكرة ل نحل العسل24.
تقليديا، تم قياس النشاط الأنزيمي للمجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام راديولابيليد النقطة225، الأمر الذي يتطلب توفير التدريب المناسب والمعدات والمرافق. ركيزة فلوروجينيك اصطناعية للمجلس التشريعي الفلسطيني في الآونة الأخيرة أنشئت26، مما يجعل من السهل تقييم النشاط التشريعي في المختبر القياسية. نقدم هنا، بروتوكول مفصلة للكشف عن النشاط التشريعي في مناطق مختلفة من الدماغ لنحل العسل باستخدام الركيزة فلوروجينيك واختبار الآثار المثبطة اديلفوسيني والنيوميسين على المجلس التشريعي الفلسطيني في وقت لاحق في هذه الأنسجة. لأنه يتطلب البروتوكول التلاعب الأساسية فقط، قد يكون المطبقة على الدراسات المتعلقة بالنشاط التشريعي في أنسجة أخرى أو مناطق الدماغ في النحل المخصصة للمهام الاجتماعية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة الكيمياء الحيوية لنشاط البروتين مهم عميقا لفهم الإشارات الجزيئية في الدماغ، ونظرا لأن نشاط إنزيم تتأثر جزيئات مختلفة، مثل ركائز ومثبطات، وتغيير، ومن ثم، جنبا إلى جنب مع سلوك الحيوانات (مثلالتعلم والذاكرة)5. أفيد في دراسات نحل العسل، والأنزيمات مثل أمبير سيكليك-تع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعديل الشكل 4 باء – 4 د من سوينامي et al. 24 بالإذن من “فتح علم الأحياء”. الكتاب ممتنون للناشر للحصول على إذن. وأيد هذا العمل “برنامج العلوم الحدود البشرية” (RGY0077/2016) ميازاكي ريو وشوتا سوينامي.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -. M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -. X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
