JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

Published: October 02, 2018
doi:
10.3791/57998
, , , , , , ,
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering,Harvard University, 2Department of Genetics,Harvard Medical School, 3Department of Pathology,Massachusetts General Hospital, 4Institute for Medical Engineering & Science,Massachusetts Institute of Technology, 5Synthetic Biology Center,Massachusetts Institute of Technology, 6Department of Biological Engineering,Massachusetts Institute of Technology, 7Broad Institute

Summary

Burada, bir basit, verimli ve sgRNA klonlama düşük maliyetli yöntemi anlattı.

Abstract

Anahatları belirlenmiş iletişim kuralı Cas9 ilişkili Kılavuzu RNA’ların verimli ve düşük maliyetli üretimi için standartlaştırılmış yöntemler açıklanır. Kılavuzu RNA (gRNA) klonlama için iki alternatif strateji türü IIS Restriksiyon enzimi BsmBI birlikte kullanımını uyumlu vektörel çizimler bir dizi temel özetlenmiştir. Oluşturulan vektörel çizimler doğrulamak için Sanger sıralama hizmetlere erişimin dışında hiçbir özel ekipman veya reaktifler modern Moleküler Biyoloji Laboratuvarları için standart olan dışında gereklidir. Seviyelendirilmiş Yöntemi öncelikle bir tek gRNA veya bir eşleştirilmiş gRNA ifade vektör teker teker klonlama için hazırlanmıştır. Bu yordamı de gRNAs binlerce içeren kitaplıkları oluşturmak için ölçek değil. Bu amaçları için alternatif kaynaklar oligo-çip sentezi gibi oligonükleotid sentezi önerilir. Son olarak, bu iletişim kuralını memeli vektörler kümesi üzerinde duruluyor olsa da, genel strateji plastik ve uygun gRNA vektör varsa herhangi bir organizma için geçerlidir.

Introduction

CRISPR ilişkili 9 (Cas9) hangi istenen genomik hedef zaman uygun şekilde tasarlanmış bir küçük kılavuz RNA (gRNA)1,2ile complexed yönelik bir RNA güdümlü endonükleaz proteindir. gRNAs genomik hedef sıra için tamamlayıcı bir 20-nükleotid dizisi (protospacer) oluşturmaktadır. Yanındaki genomik hedef Cas9 bağlama için gerekli olan bir 3′ protospacer ilişkili motifi (PAM), sırasıdır. Streptococcus Pyogenes Cas9 durumunda (SpCas9), bu sıra NGG vardır. DNA hedef bağlama üzerine Cas9 DNA, böylece ilgi odağı değiştirmek için istismar tamir mekanizmaları uyarıcı her iki ipliklerini cleaves. Aktivasyonu hataya sigara-homolog son katılma (NHEJ) bir hedef gen bozulmasına neden olabilir. Bir donör şablonu6sağlanıyorsa alternatif olarak, yapılan onarım yoluyla Homolog rekombinasyon istenen bir DNA dizisi hedeflenen entegrasyonu teşvik edebilirsiniz. Nükleaz ölü Cas9 (dCas9) türevleri de olabilir oluşturulan3 endonucleolytic aktivite için gerekli olan artıkları Cas9 içinde diziyi değiştirerek. dCas9 DNA bağlama için yetkili kalır, ancak ilişkili hedefine uygun değil. DCas9 çeşitli efektör etki alanlarına eritme ve yakın bir genin transkripsiyon başlangıç bölgesi yönetmenlik, dCas9 seçici gen indüksiyon veya kısmi gene4,5susturmak için kullanılabilir.

İnanılmaz güçlü olmakla birlikte, bir Kullanıcı ilk hedef site (ler) için benzersiz bir gRNA oluşturur faiz genomik bir dizi hedef için Cas9 kullanma yeteneğini gerektirir. Çeşitli yöntemler gRNA ifade vektörel çizimler oluşturmak için daha önce açıklanan, birçok farklı verimlilik edilmiş ve6,7,8maliyet. Tek başına PCR amplicons gRNAs transfection birkaç saat içinde oligonükleotid teslim arasında gidiş hızlı tarama için kullanılabilir; Ancak, bu Ultramer gerektirir (100’den fazla bp) pahalı9oligo sentezi. Ultramers daha düşük maliyetli gBlocks satın almak mümkündür. Cas9 hızla modern moleküler biyoloji Araç Takımı’nın ayrılmaz bir bileşeni haline gelmiştir, gRNA klonlama için basit, ucuz ve yüksek verimli bir yöntem alanı için bir nimet olacaktır. Burada açıklanan yöntemi bizim grup ve birlikte çalışan laboratuvarlar için son birkaç yıl içinde 2000’den fazla benzersiz gRNAs4oluşturmak için istihdam edilmiştir.

Seviyelendirilmiş yöntemi tek bir gRNA veya en az iki gRNAs içeren lentiviral uyumlu vektörlerinin klonlama teknikleri üzerinde duruluyor. İkiden fazla gRNAs içeren plazmidleri veya gRNAs bir kütüphane Clone oluşturulmasında,9,10,11,12alternatif yaklaşımlar tavsiye edilir.

Protocol

Not: Aşağıdaki protokol bu el yazması ayrıntılı gRNA plazmid inşaatın tüm yöntemleri için ortak olan çevrimiçi araçlar (adım 1.1-1.4), kullanarak gRNA tasarımı gerçekleştirmek nasıl belirleneceğini açıklar. İstenen gRNAs tanımlandıktan sonra gerekli oligonucleotides sipariş için adımlar ile birlikte oligonucleotides ifade vektörel çizimler (Örneğin, pSB700) tanıtmak için birkaç farklı yöntem açıklanmaktadır. Sunan her iki ligasyonu Devrimciliğini ifade vektör (adım 2-7,3) içine ya da Golden Gate (adım 8-8.4) klonlama dayalı tek Kılavuzu ifade vektörel çizimler klonlama için 2 yöntem vardır. Daha fazla özetlenen polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Golden Gate (adım 11-16) klonlama tarafından takip kullanarak klonlama eşleştirilmiş Kılavuzu ifade vektörel çizimler için bir stratejidir. Son olarak, bir E. coli kimyasal dönüştürme (adım 9-9,6) ve bir ifade vektör sıra doğrulama (adım 10-10.2.3) gerçekleştirmek için ortak yöntemleri de açıklanmaktadır. GRNA oligonucleotides gibi çevrimiçi araçlar kullanarak tasarlayın. SgRNA golcü 2.0 çevrimiçi araç (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 gibi çevrimiçi araçlar veya geniş sgRNA tasarım aracı (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ gibi alternatifleri kullanarak tasarım gRNAs sgrna-tasarım)14 ve diğer bazı kişilerin15. Gen adı, sembol veya ham DNA hedef dizilerinin potansiyel gRNA dizileri oluşturmak için kullanın.Not: Tüm olası gRNAs karşı gen veya sağlanan sıra ile bir elektronik tablo (.csv/.xls) dosyası oluşturulur. Geniş sgRNA tasarım aracı kullanılıyorsa, potansiyel gRNAs kalitesini sgRNA golcü 2.0 çevrimiçi araç kullanılıyorsa, skor , veya % üzerinde-hedef verimliliği olarak rapor edilecektir. Her iki önlemler, hedef üzerinde kesme faaliyete dayalı elde edilmiştir. Hedef kapalı aktivite gRNA seçim gRNAs sıralama yaparken göz önünde bulundurun.Not: En iyi kılavuzları en büyük hedef üzerinde verimlilik ve az kapalı hedefi faaliyeti ile bunlar. İçin harekete geçirmek (CRISPRa), gRNAs 1-200 kan basıncı upstream transkripsiyon başlangıç sitesi (TDH)4,15bölgesinden hedeflemek için tasarlanmıştır. İnhibisyon (CRISPRi) için gRNAs 50 bölgesinden hedeflemek için tasarlanmıştır kan basıncı upstream 300 kadar TSS, kan basıncı aşağı TSS5. Cas9 kesme kullanarak bir genin devre dışı bırakmak için gRNAs ilk 10-, başlatan kodon (olarak gRNAs Gen 3′ sonu daha az etkili olduğu gösterilmiştir hedefleme)13kodlama dizi akıntı yönünde hedeflemek için tasarlanmıştır. Bu tavlanmış oligonucleotides yol açar gibi hiçbir iç BsmBI siteleri oligonucleotides Golden Gate klonlama için kullanılıyorsa, mevcut olduğundan emin olun olmak sindirilmiş13. Genomik hedef serileri seçin ve 3′ NGG (sadece protospacer sıra bırakarak) PAM kaldırmak için tek gRNA oligonükleotid sıra değişiklik (sıra BaşlangıçÖrneğin,: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).Not: bir elektronik tablo kullanıyorsanız, aşağıdaki formül 3′ NGG-ecek çıkarmak: A2 hücre nerede =LEFT(A2,LEN(A2)-3), hedef sıra ve PAM içeren. CACCG 5′ oligo ekler.Not: pSB700 omurgasına ligasyonu 3′ ucu gRNA transkripsiyon sürüş U6 düzenleyicinin bu sırayı oluşturan. “CACC” sıra oligo BsmBI sindirilmiş pSB700 vektör çıkıntılar ile uyumlu olmasını sağlar. “G” polimeraz III Rehberleri bir gereksinimdir ve gRNA, transkripsiyon verimli başlatılması sağlar. Bu görevi gerçekleştirmek için bir elektronik tabloda aşağıdaki formülü kullanın: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2))B2 hücre nerede, protospacer sıra içeren [5′ CACCG sıra protospacer için eklemeÖrneğin,: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (Bu Sipariş son ileri oligo olduğunu)]. Protospacer sırası ters tamamlayıcı (rc) oluşturun.Not: Örneğin, TGGATGAGGGAGAGCACGCG söz konusu protospacer geriye doğru tamamlayıcı olur. AAAC 5′ rc protospacer ekler. Bir ek C 3′ rc protospacer (ters oligo) ekler.Not: “AAAC” sıra oligo BsmBI sindirilmiş pSB700 vektör klonlama için uyumlu olmasını sağlar. 3′ ucunda ek “C” “başlatan G ileri oligo eklendi” dizisine tavlamak için gereklidir. Kullanım Bu gerçekleştirmek için bir elektronik tablo aşağıdaki formülde görev C2 hücresi nerede =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), geriye doğru tamamlayıcı sıra [Örneğin, (Bu, bu son ters oligo AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC içeren sıralı)]. Oligonucleotides oligonucleotides üzerinde hiçbir ek değişiklikler ile sipariş. Yalnızca çok küçük miktarlarda klonlama reaksiyonlar için gerektiğinde oligo gerekli, en az miktarda sipariş. 1 TE arabellek (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 ile 1 mM EDTA) x 100 mikron son bir konsantrasyon için liyofilize astar sulandırmak. Aliquot 1:1 ileriye ve geriye doğru oligonucleotides (Örneğin, 10 μL her) PCR şerit-cap tüpler içine.Not: Bu hızlı birçok gRNAs bir çok kanallı pipet kullanarak bir defada klonlama sağlar. Girdap ve spin aşağı oligo karışımları (100 x g 15 s). Ligasyonu ayarlamadan önce tepki, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.Not: Isı ve onların tavlama kolaylaştırmak için oligo karışımları serin gerek yoktur. Bu gRNA oligonucleotides 3-4 çift havuza alınmış ve tek bir reaksiyon komplementer dikkati çeker (Örneğin, mix 3 μL ileri ve, 3 μL ters oligonucleotides birlikte 24 μL toplam hacmini veren 4 gRNA oligo çiftlerinden). Tavlama için kullanılan oligonucleotides hacmi bir kullanıcının ihtiyaçlarını karşılamak için ayarlanabilir.Not: Adımlar 6-7,3 pSB700 salınımı açıklar. Alternatif bir yöntem için bkz: adım 8, bir tek adım BsmBI kısıtlama ligasyonu açıklanır. Seçili pSB700 Kılavuzu ifade vektör BsmBI ile 1-5 μg sindirmek (1 μg başına 0.5 μL) 55 ° C151 h için. PSB700 gRNA ifade vektör toplam hacmi 40 μL (Tablo 1), hazım kuralları. Sindirim ürünleri % 1,5 (wt/vol) düşük erime özel jel üzerinde çalıştırın. ~ 9 kb boyutunda bir parçası karşılık gelen sindirilir vektör omurga grup kesip ve jel dilim bir 1.5 mL microcentrifuge tüp (Şekil 1) yerleştirin. Bir ticari jel arıtma kit özel jel üreticinin talimatlarına göre DNA ayıklamak için kullanın. DNA TE arabellek (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) yoğun bir eluate elde etmek için 10-15 μL elute. Adım 4 BsmBI sindirilmiş pSB700 Kılavuzu ifade vektör 20 μL tepki (Tablo 2) içine tavlanmış gRNA oligonucleotides gRNA oligonucleotides önceden sindirilmiş pSB700 ifade vektör klonlama için ligate. İlk olarak, su, tampon ve DNA, sonra girdap karışımı ekleyin ve enzim, girdap enzim ve çözüm aşağı spin ekledikten sonra 1 son kez ekleyin (100 x g 15 s). Oda sıcaklığında reaksiyonlar gecede kuluçkaya. Bir BsmBI sindirilmiş vektör yalnız tavlanmış gRNA oligo INSERT vardır bir Hayır-INSERT negatif kontrol reaksiyon içerir. 1 μL su gRNA oligonucleotides 1 μL yerine no-INSERT negatif kontrol için kullanılabilir. Dönüştürme (adım 9) devam etmek.Not: Adım 8 6-7,3 adımlarda açıklandığı gibi pSB700 salınımı için alternatif bir yöntemdir. GRNA oligonucleotides (özetlenen adımlar 1-5.1) Golden Gate tek adım BsmBI kısıtlama ligasyonu için klonlama yoluyla pSB700 vektör içine tanıtmak. Ana mix (1 x) araya — birden çok gRNAs klonlanır, ana karışımı hazırlamanız eklendi ekle oligonucleotides (Tablo 3). Aliquot asıl PCR tüpler içine karıştırın ve bir çok kanallı pipet gRNA oligonucleotides adım 4.2 eklemek için kullanın. Su 1 μL kullanarak bir no-Ekle denetimini içerir. BsmBI enzim ve T4 DNA ligaz aynı tepki içinde dahil ederek, eşzamanlı kısıtlama sindirim ve ligasyonu elde edilir (yani, Golden Gate klonlama). Vektör sindirmek ve 1 tepki olarak ekler ligate için aşağıdaki basit kapı protokolü kullanın: 15 dakika, 80 ° C’de 15 dakika 65 ° C’de 10 dakika için 50 ° C’de 2 h 37 ° C’de reaksiyonu tutmak ve nihayet , 4 ° C’de tutun Not, oligonucleotides BsmBI siteleri bu yöntemi kullanmadan önce içermediğinden doğrulayın. Klonlanmış gRNAs BsmBI kısıtlama siteleri içeriyorsa, BsmBI eklenmesi sindirilmiş. Bu Kullanıcı herhangi bir transformants elde etmesine engel. İlk basit kapı tepki sonra her tepki BsmBI enziminin bir ek 0,5 μL ekleyin ve onları geri 55 ° C için 1 h yerleştirin. Sindirim sonra reaksiyon 4 ° C’de tutun veya dönüştürmek için hazır kadar dondur. Restriksiyon enzimi kuluçka bu ikinci tur daha sindirilmemiş kaldırır veya religated vahşi tipli pSB700 vektör omurga tepki karışımından oligo ekler almış tek vektörel çizimler korunacak ve transformants ortaya çıkarır. Dönüştürme (adım 9) devam etmek. 0.5 μL tepki karışımı yetkili E. coli [Örneğin, NF’leri DH5a (109 cfu/µg pUC19 DNA’ın x 1-3) veya NF’leri istikrarlı 1 – 3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA’ın). 8 μL dönüşümü Lentiviral plazmid için NF’leri istikrarlı hücreleri daha tutarlı plazmid verimi sağlar. E. coli -80 ° C’de depodan kaldırma ve 5-10dk için buz çözme. Yetkili E. coli 8 μL 0.5 μL tepki karışımı ekleyin ve karışımı 30 dk için buz üzerinde tutun. Isı şok karışımı 45 için 42 ° C’de s. 2 min için buz üzerinde bekletin. Kültür SOC kitle 250 μL döner bir shaker NF’leri DH5a için 37 ° C’de ve NF’leri ahır için 30 ° C’de 1 h için Tarih yeniden elde etmek. Uygun antibiyotik direnci Lysogeny suyu (LB) plaka üzerinde kültürünün 80 μL plaka ve gecede NF’leri DH5a için 37 ° C’de ve NF’leri ahır için 30 ° C’de kuluçkaya [Örneğin, pSB700 kaplama üzerinde LB ile ampisilin (100 μg/mL) plakalar] (Şekil 3). GRNA ifade plazmid dizi doğrulamak: her koloni astar 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 kullanarak sıralama Sanger tarafından sırasını doğrulayın ‘ U6 organizatörü akıntıya karşı hangi asal gRNA oligo yerleştirin. 2-3 kolonileri reaksiyon (Tablo 4) sıralama için ücret almak.Not: teklif hizmetleri şimdi birkaç sıralama sağlayıcısı Sanger gerçekleştirebilirsiniz büyük ölçüde sıralama öncesinde plazmid arındırmak için gereksinimini ortadan kaldırarak süresini ve maliyetlerini azaltır doğrudan bakteri kolonileri üzerinden sıralama. Alternatif olarak, bir plasmid izolasyon kit plazmid DNA bireysel bakteriyel klonlar kurtarmak için kullanılabilir. Arıtılmış plazmid sonra sıralama için gönderilmiş. Bir havuza alınan ligasyonu tepki gerçekleştirilirse, Tablo 4 seçili olmalı ve sıralama için gönderilmiş koloni sayısı için bir kılavuz olarak kullanın. Sıra onay gRNA ifade plazmid yalıtmak. Steril pipet ucu 100 μg/mL pSB700 ifade vektörel çizimler için ampisilin içeren LB orta 5 mL kültürünün içine istenilen koloni aşılamak için kullanın. 37 ° c gece (30 ° NF’leri ahır kullanılıyorlarsa C) 100 rpm’de döner bir kuluçka hücrelerin büyümesine. Üreticinin protokol sonrası bir plazmid hazırlık seti kullanarak kültürlerden plazmid DNA izole et.Not: Yukarıdaki yöntemleri tek gRNA içeren vektörel çizimler oluşturmak kullanıcılar sağlar iken, bu protokol kullanıcılara 2 gRNAs, her kendi RNA polimeraz III düzenleyici tarafından tahrik içeren vektörel çizimler oluşturma sağlayacaktır. Eşleştirilmiş gRNA tasarım sgRNA tasarım araçları (yukarıdaki adımları 1.1-1.4) özetlenen çıkış dosyasından kullanın ve ilgi 2 kılavuzları seçin. Bir harekete geçirmek ya da baskı için en az 30 yaşın kılavuzları çiftlerini seçin nt ayrı. Kesim için kullanılan gRNAs için 2 farklı ekzonlar gen içinde hedef kılavuzları seçin. Aşağıdaki talimatları için gRNA-bir dizideki ilk gRNA ve dizi gRNA-bir eşleştirilmiş gRNA oligonükleotid sıra değişiklik oluşturmak için b, ikinci gRNA gösterin.Not: gRNA-bir oluşturmak için kullanılan oligo SK adı verilecek ve gRNA-B tanıtmak için kullanılan ters oligo rB ifade edilecektir. Aşağıda klonlama yöntemi otomatik olarak başlatan bir G 5′ uç her birinin gRNAs de ekler. Uygun SK oligo aşağıdaki gibi oluşturun.Not: bunun üzerine (Örneğin, protospacer – aggggctacaccactcattg) aşağıdaki adımları inşa edecek ilk SK sıra sıra gRNA-A will için hedefleme gRNA oluşan 20 nükleotit oluşturur. TTTTCGTCTCTCACCG 5′ SK (Örneğin, TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg dizisinin) ekler. GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA 3′ SK (Örneğin, TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAdizisinin) ekler. Bu sipariş edilebilir SK oligo son sürümüdür. Gerekli rB oligo aşağıdaki gibi oluşturun.Not: bunun üzerine (Örneğin, başlangıç sıra gtcccctccaccccacagtg in) aşağıdaki adımları inşa edecek başlangıç rB dizisini gRNA-B gRNA hedefleme sırasını oluşan 20 nükleotit teşkil edecektir. RB ters tamamlayıcı Al (revcom) = rB (Örneğin, cactgtggggtggaggggac). TTTTCGTCTCTAAAC (revcom) 5′ sonuna ekleme rB (Örn., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG (revcom) 3’ sonuna ekleme rB (Örneğin, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Bu sipariş edilebilir rB oligo son sürümüdür.Not: aşağıdaki formülleri ile ortak elektronik tablo yazılımı otomatik olarak oligo dizileri düzenlemek için kullanılabilir: CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), “GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA” =), A2 SK sırasını ve içeren hücreye olduğu yerde = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2),”CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), (revcom) rB sıra içeren hücre B2 olduğu yerde. Oligonucleotides seçim bir sentez satıcıdan sipariş. Hiçbir ek değişiklikler gereklidir. Hazırlanan plazmid DNA PCR SK ve rB astar ile gerçekleştirmek için kullanın. Bu her iki ileri eklemek olacaktır ve bu plazmid ve üretilen PCR parçası için geriye doğru gRNAs kendi organizatörü ifade edilecek izin vermek (U6 ve 7SK Rehberleri — farklı Rehberleri viral rekombinasyon önlemek için bu tasarımda kullanılan). Phusion GC özel PCR protokolü gerekli parça oluşturmak için kullanın: 15 98 ° C’de 1 dk (1 dönüşü), 98 ° C’de karışımı tutmak s, 15 53 ° C’de s, 2 dk 65 ° C’de ve 4 dk (30 döngüleri) için 72 ° C’de ve sonra 4 ° C’de (Tablo 5) basılı tutun. PCR ürünü % 1’özel jel üzerinde çalıştırmak ve 1 Grup ~ 490 görülür doğrulayın bp (Şekil 2). Kes ve bir jel ekstraksiyon kiti tercih kullanarak bu PCR ürünü ayıklayın. DNA TE arabellek (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) 15 μL elute veya distile su. DNA derişim hesaplaması için Spektrofotometre ile birlikte bu pSB700 vektör ayıklanan ürün konsantrasyon ölçmek. PCR ürünü ve 40 femtomoles/μL bir konsantrasyon için vektör normalleştirmek.Not: Çeşitli web siteleri DNA ve çözüm onun konsantrasyon uzunluğuna dayalı belirli bir DNA çözüm derişim hesaplanması ile yardımcı olmak kullanılabilir (Örneğin, Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Hesaplama formülü kullanır:Burada, N nükleotid dizisi uzunluğudur. Bir eş zamanlı kısıtlama sindirim ve ligasyonu tepki PCR parçası pSB700 vektör clone için adımları 8-8.4 sıraladı protokolü kullanarak ayarlayın. 1 μL astar çözüm için tepki eklemek yerine, 40 fmole/μL PCR ürününün 1 μL ekleyin. Buna ek olarak, pSB700 vektör 1 μL 40 fmole/μL bir konsantrasyon kullanın.Not: tam oranları değil kullanıldığı durumlarda bile kolonileri elde edilebilir, ancak tutarlı sonuçlar için eşit molar oranları yol. Golden Gate tepki süreci (adımları 8-8.4), tamamlanması üzerine dönüştürme ve sıra doğrulama (adım 9 – 10.2.3) için devam edin.

Representative Results

Bu protokol için özetlenen ya tek veya eşleştirilmiş gRNA ifade vektörel çizimler oluşturmak için yöntemlerdir. Tek gRNA vektörler ifade oluşturulan her iki kısa oligonucleotides bir dizi birleştirilmesi (ligasyon) ya da Golden Gate aynı anda vektör omurga sindirmek ve içinde ligate için klonlama kullanarak takip vektör omurga (Şekil 1) predigesting tarafından bir tek bir tepki olarak kısa oligonucleotides dizi. Ayrıca sağlanan 2 gRNAs, içeren vektörel çizimler üreten her bir özel PCR parçası (Şekil 2) klonlama tarafından kendi bağımsız düzenleyici tarafından tahrik yöntemidir. Başarılı Seviyelendirilmiş iletişim kurallarından herhangi birini için klonlama (Şekil 3) no-Ekle denetim tabakta uygun Ekle DNA ile dönüştürmeleri için önemli ölçüde daha fazla kolonileri görünümünü neden olur. Şekil 1: pSB700 gRNA ifade vektör hazım. % 1’özel jel kullanılır. Lane 1: kesilmemiş pSB700. Lane 2: pSB700 BsmBI ile kesti. Resim 2: gRNA PCR eşleştirilmiş. % 1’özel jel kullanılır. Lane 1: bir eşleştirilmiş Kılavuzu PCR Fragman ~ 490 bp. Şekil 3: başarılı klonlama ve gRNA plazmid dönüşümün. Sol bölmede bir LB gösterir ve ampisilin plaka ile başarıyla kolonileri dönüştürdü. Doğru kapı aynası yok kolonileri gösterilen bir no-Ekle kontrol plaka gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. pSB700 Kılavuzu ifade vektör 1-5 μg NF’leri arabellek 3.1 4 μL BsmBI 1 μL Distile su 40 μL Toplam hacim 40 μL Tablo 1: BsmBI ile pSB700 gRNA ifade vektör sindirim kısıtlama. Tavlanmış gRNA oligos (tek ya da havuza alınan tepki) 1 μL PSB700 BsmBI sindirilmiş Kılavuzu ifade vektör 1 μL (~ 100-250 ng) T4 DNA ligaz tepki arabellek x 10 2 μL (son konsantrasyonu x 1) T4 DNA ligaz 1 μL (120 adet) Distile su 15 μL Toplam hacim 20 μl Tablo 2: Bir tüp ligasyonu reaksiyon gRNA oligonucleotides Devrimciliğini pSB700 gRNA ifade vektör içine. Reaktif Cilt (1 x) H2O 6 μL T4 ligaz 0.5 μL ATP 1 μL BsmBI 0.5 μL NF’leri arabellek 3.1 1 μL Vektör (Örneğin, pSB700) (40 fmol) 1 μlL Ekle – ileri ve ters oligos veya çift Kılavuzu (40fmol) için PCR parçası 1 μL (0.5 μL ileri ve 0.5 μL ters) Tablo 3: Mix bir tek adım BsmBI kısıtlama ve gRNA tüp ligasyonu tepki. 1 Kýlavuzu sıra 3 kolonileri 2 kılavuzları için 5-10 kolonileri sıra 3 kılavuzları 10-15 kolonileri sıra 4 kılavuzları için 15-20 kolonileri sıra Tablo 4: Kolonileri diziye havuza alınan gRNA reaksiyonlar klonlama için önerilen sayısı. PCR bileşen 50 µL tepki 10 µM ileri astar 2.5 ΜL 10 µM ters astar 2.5 ΜL 5 x Phusion HF veya GC arabellek 10 ΜL 10 mM dNTPs 1 ΜL Şablon DNA 100 ng Phusion DNA polimeraz 0.5 ΜL Nükleaz ücretsiz su En fazla 50 µL Tablo 5: Bir eşleştirilmiş gRNA PCR karışımı.

Discussion

Zaman ve maliyet tasarrufu değişiklikler bir dizi gRNA ifade vektör İnşaat için yapılmıştır. Bir tek adım kısıtlama ve ligasyonu protokol eşleştirilmiş gRNA ifade vektör inşaat yöntemi yanı sıra gösterilmiştir. Eşleştirilmiş gRNA ifade içeren bir ileri gRNA hedef sıra (n20) ve başka bir hedef (n20) geriye doğru tamamlayıcı oligonucleotides kullanarak bir PCR güçlendirme elde edilir. Bu daha sonra bir sgRNA kuyruk yanı sıra geleneksel tek gRNA ifade plazmid ifade içine ikincil bir RNA Pol III organizatörü (7SK) tanıtır.

Dikkatli oligonükleotid tasarım için eşleştirilmiş gRNA inşaat hem hem bir yapışkan uç ligasyonu başarılı bir PCR sağlayacaktır. Tek adım kısıtlama ve ligasyonu tepki, daha fazla BsmBI eklenmesi aşağıdaki reaksiyon bütün değiştirilmemiş ifade vektörel çizimler kesilir sağlayacaktır. Bu arka plan dönüştürme üzerine önemli ölçüde azaltacaktır. NF’leri-kararlı yetkili E. coli ve bir büyüme 30 ° C’de kullanılması başarılı bir dönüşüm verimi artırır.

Tavlama, gRNA ifade vektör tek adım sınırlandırılması ve oligonucleotides ve geleneksel kullanma özelliğini ligasyonu oligonükleotid sürecinin basitleştirilmesi bu tekniği üzerinde ortak uygulamalar vardır avantajları şunlardır eşleştirilmiş kılavuzları bir ifade için tek gRNA ifade vektörel çizimler. Protokol tanımlamak burada odaklanır memeli vektörler kümesi üzerinde iken, genel strateji plastik ve uygun gRNA vektör kullanılabilir olması koşuluyla herhangi bir organizma için geçerlidir. Genel olarak, açıklanan protokol zaman ve maliyet kaydeder.

Ancak, bireysel oligonucleotides satın alma özetlenen yordamı de gRNAs binlerce içeren kitaplıkları oluşturmak için ölçek değil unutulmamalıdır. Bu amaçları için alternatif kaynaklar oligo çip sentezi gibi oligonükleotid sentezi önerilir.

Ne zaman gRNAs klonlama bir no-Ekle denetimini eklemek faydalıdır. Bu reaksiyon kolayca reaksiyonlar ilgi ile paralel olarak ayarlanabilir ve başlangıç vektör eksik bir sindirim yordamın bitiminde gözlenen kolonileri katkıda bulunmuştur olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, yukarıdaki klonlama protokollerden birini bir eksik olarak sindirilir vektör omurga veya zavallı ligasyonu verimliliği nedeniyle başarısız olursa, biz belirttiğimiz yöntemi klonlama alternatif denemenizi öneririz.

Golden Gate aynı anda vektör sindirmek ve tek bir tepki içinde küçük oligonucleotides içinde ligate için klonlama kullanırken, bu t için yol açacaktır vektör klonlanır gRNA, içinde bir BsmBI sitede yok kontrol önemlidir o gRNA kesilmiş ve koloniler dönüştürme üzerine olmayışı.

Biz belirttiğimiz strateji klonlama gRNA gRNAs Kılavuzu, başına ~ 10 $, hızlı ve düşük maliyetli nesil oligonükleotid sentezi ve sıra doğrulama gelen maliyeti toplu ile sağlar. Seviyelendirilmiş yöntemi gRNAs SpCas9 ile kullanmak için oluşturmak kullanıcılara izin vermek için tasarlandığından, protokol kolayca Cas9 orthologues veya diğer RNA güdümlü endonucleases Cpf1 veya C2C2, gibi vektör omurgasına hafif değişiklikler ile ile kullanmak için adapte edilebilir ve oligonükleotid çıkıntı16,17diziler.

Yukarıda belirtilen iletişim kuralı geçerli yöntemlerden daha önemli ölçüde daha hızlı olduğu ifade plazmid (uygun şekilde tasarlanmış oligonucleotides ile başlayan) 3 d sıra onaylı gRNA sağlayacaktır. Bu 1 h (adım 1-2,3), seyreltme ve 10 dk (adım 3-5.1), sindirim ve pSB700 gRNA ifade vektör 2 h (adım 6-6.4), gRNA oligonucleotides bir predi klonlama arıtma oligonucleotides aliquot gRNA tasarımını içerir zamanla pSB700 gRNA ifade vektör gecede oda sıcaklığında (adım 7-7.3), tek adım BsmBI kısıtlama ligasyonu 3 h ve 40 dk (adım 8-8.4), 16 h (adım 9-9,6) dönüşümü ve doğrulama, gRNA ifade plazmid dizi 24 h (süreli sanger sıralama durumu ve bakteriyel koloni; sunulması takip hız bağlı olarak adım 10). Eşleştirilmiş gRNA tasarım ve sıra değişiklik alır 1 h (adım 11-13). Eşleştirilmiş gRNA PCR 3,5 h (adım 14-14,4) alır. PCR parçası pSB700 vektör klonlama 3 saat ve 40 dakika (adım 15-16) alır.

Bu iletişim kuralı ile karşı karşıya en olası sorunları verimsizlik Golden Gate derleme ve dönüşüm ile ilgili. Bir no-Ekle denetim derleme verimliliğini görselleştirmek için Golden Gate derleme sırasında içerir. Dönüştürme sırasında puc19 olumlu denetim bir dönüşüm verimliliği denetim sağlar. NF’leri-kararlı E. coli lentiviral uyumlu plazmid için kullanılması gerektiğini ve sık sık en fazla > 16 saat 30 ° C’de görülebilir koloniler vermeye gerektirir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sathiji Nageshwaran Friedreich’s ataksi araştırma İttifak tarafından desteklenmektedir (07340305 – 01) ve ulusal ataksi Vakfı Bursu (7355538-01). Alejandro Chavez tıp bilim adamları için Ulusal Kanser Enstitüsü grant 5T32CA009216-34 ve Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü tarafından finanse edildi. George M. Church ABD ulusal kurumları sağlık (NIH tarafından) desteklenen Ulusal insan Genomu Araştırma Enstitüsü grant RM1 HG008525 ve biyolojik olarak ilham mühendislik Wyss Enstitüsü. James J. Collins Savunma Tehdit Azaltma Ajansı hibe HDTRA1-14-1-0006 ve Paul G. Allen ufuklar grup destek kabul eder. Alejandro Chavez çift-Kılavuzu klonlama yöntemi geliştirdi. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez ve Nan Cher Yeo el yazması girişli tüm yazarlar yazdı.

Materials

BsmBI New England Biolabs R0580L
T4 DNA ligase Enzymatic/New England Biolabs L6030-LC-L/M0202S
Buffer 3.1 New England Biolabs B7203S
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104
Chemically competent E. coli New England Biolabs C3019l, C2987l, or C3040H
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 0030 125.150
Axygen 8-Strip PCR tubes Fischer Scientific 14-222-250
Thermocycler with programmable temperature-stepping control BioRad, 1851148
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) Thermo Scientific
pSB700 plasmid Addgene #64046
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs c3040
Lysogeny broth (LB)
Ampicillin
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  2. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
  4. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  5. Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  6. Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
  7. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  8. Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
  9. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  10. Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  11. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
  12. Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
  13. Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  14. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
  15. Engler, C., Marillonnet, S., Valla, S., Lale, R. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. , 119-131 (2013).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).

Tags

CRISPRGuide RNACloningMammalian SystemPlasmidSingle-guide RNAOligonucleotideLigationE. ColiCompetent CellsTransformation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nageshwaran, S., Chavez, A., Cher Yeo, N., Guo, X., Lance-Byrne, A., Tung, A., Collins, J. J., Church, G. M. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. J. Vis. Exp. (140), e57998, doi:10.3791/57998 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image