哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

注: 次のプロトコルは、この原稿の詳細 gRNA プラスミド構築のすべての方式に共通である (1.1 から 1.4 のステップ)、オンラインのツールを使用して gRNA デザインを実行する方法をについて説明します。目的の gRNAs が識別されると、必要なオリゴヌクレオチドを注文するための手順は表現のベクトル (例えばpSB700) にオリゴヌクレオチドを導入するためのさまざまな方法と共に記載します。提示は損なった発現ベクター (ステップ 2-7.3) にどちらの結紮またはクローン作成 (手順 8 8.4) ゴールデン ゲートに基づく単一ガイドを表現するベクトルのクローニングのための 2 つの方法です。さらに説明はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 続いてゴールデン ゲート (手順 11 16) をクローニングを使用してクローン対ガイドを表現するベクトルの戦略です。最後に、大腸菌の化学的変化 (手順 9 9.6) と式ベクトル シーケンス検証 (ステップ 10 に 10.2.3) を実行するための一般的な方法のとおりもです。 オンライン ツールを使用して次のように gRNA オリゴヌクレオチドをデザインします。 SgRNA 得点 2.0 オンライン ツール (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13などのオンライン ツールや広範な sgRNA デザイン ツール (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ などの選択肢を使用してデザイン gRNAssgrna-デザイン)14といくつかの他15。 潜在的な gRNA のシーケンスを生成するのに遺伝子の名前、シンボル、または生の DNA ターゲット シーケンスを使用します。注: 遺伝子または指定したシーケンスに対してすべての潜在的な gRNAs を持つスプレッドシート (.csv/.xls) ファイルが作成されます。広範な sgRNA デザイン ツールを使用している場合、潜在的な gRNAs の品質は、得点sgRNA 得点 2.0 のオンライン ツールを使用している場合、または% ターゲット効率として報告されます。両方の措置は、切削対象のアクティビティに基づいてに派生しています。 GRNAs をランク付けするときは、gRNA 選択のターゲットからの活動を検討してください。注: 最適なガイドは、最大のターゲットに効率と少なくともオフ対象のアクティビティ。活性化 (CRISPRa)、gRNAs 遺伝子の転写開始サイト (TSS)4,15の 1 200 bp を上流から地域を対象に設計されています。抑制 (CRISPRi)、gRNAs、50 から地域を対象に設計されています 300 まで TSS の bp を上流下流の TSS5bp。遺伝子の Cas9 の切断の使用を無効にするには、gRNAs は、開始コドン (gRNAs ターゲット遺伝子の 3′ 末端がより少なく有効であること示されている) として13の下流コーディング シーケンスの最初の 10-50% をターゲットに設計されています。 内部の BsmBI サイトがないを確認オリゴヌクレオチドは、ゴールデン ゲートのクローン作成のために使用されている場合これは焼なましオリゴヌクレオチドになります13を消化されています。 ゲノムのターゲット シーケンスを選択し、削除 3′ NGG PAM (protospacer シーケンスのみを残して) シングル gRNA オリゴヌクレオチド シーケンス変更のため (例えばシーケンスを開始: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG)。注: ワークシートを使用する場合、次の数式は削除されます 3′ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3)A2 のセルは、そのターゲット シーケンスおよび PAM 含んでいます。 オリゴの 5′ 末端にCACCGを追加します。注: pSB700 のバックボーンに結紮術は、時にこのシーケンスは、gRNA のトランスクリプションを運転する U6 プロモーターの 3′ 末端を構成します。”CACC”シーケンスは、oligo BsmBI 消化 pSB700 ベクトルの張り出しと互換性のあることを保証します。”G”はポリメラーゼ III のプロモーターの要件であり、gRNA の転写の効率的な開始を確認します。スプレッドシートで次の数式を使用して、このタスクを実行する: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2))B2 がセル protospacer シーケンスを含む [例えば、5′ CACCG、protospacer にシーケンスを追加する: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (これですが注文最終前方オリゴ)] Protospacer シーケンスの逆の補数 (rc) を作成します。注: たとえば、前述の protospacer の逆の補数は TGGATGAGGGAGAGCACGCG です。 Rc protospacer の 5′ 末端に AAAC を追加します。Rc protospacer (逆オリゴ) の 3′ 末端に追加 C を追加します。メモ:”AAAC”シーケンスは、oligo BsmBI 消化 pSB700 ベクターにクローニングに互換性があることを確認します。発信側の”G”は、前方のオリゴを追加するシーケンスをアニールする 3′ 端に追加の”C”です。これを実行するワークシートに次の数式を使用してタスクの=CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”)C2 がセルを逆の補数シーケンス [例えばAAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (これは、最終的な逆オリゴを含む命じた)] オリゴヌクレオチドの追加変更なしで、オリゴヌクレオチドを注文します。 非常にごく少量のクローニングの反作用のために必要な最小限の必要なオリゴを注文します。 1 TE バッファー (10 mM Tris Cl、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) x 100 μ M の最終的な集中に凍結乾燥させたプライマーを薄くしなさい。 分注 1:1 前方および逆引きオリゴヌクレオチド (例えば、10 μ L 各) PCR ストリップ キャップ チューブに。注: これは、マルチ チャンネル ピペットを使用して一度に多くの gRNAs の迅速なクローニングなります。 渦とスピン ダウン オリゴ混合物 (100 x 15 g s)。結紮を設定する前に 5 分間室温で反応を孵化させなさい。注: 熱し、のアニーリングを容易にする oligo の混合物を冷却する必要はありません。GRNA オリゴヌクレオチドの 3-4 組のプールし、焼なましを単一の反作用で可能性があることは注目に値するがそれ (例えばフォワードのミックス 3 μ L、3 μ から逆にオリゴヌクレオチド一緒に最大 4 gRNA オリゴ ペア、24 μ L の総ボリュームを与える)。アニール用オリゴヌクレオチドのボリュームは、ユーザーのニーズに合わせて調整できます。注: 手順 6 7.3 は、pSB700 の predigestion をについて説明します。別の方法、シングル ステップ BsmBI 制限結紮について説明します手順 8 を参照してください。 BsmBI で選択した pSB700 ガイド式ベクトルの 1-5 μ g を消化 (1 μ g 当たり 0.5 μ L) 55 ° C の15で 1 時間。40 μ L (表 1) の総量 pSB700 gRNA 発現ベクターの消化を行います。 1.5% (重量/巻) 低融点アガロース ゲルの消化力製品を実行します。 ~ 9 kb のサイズのフラグメントに対応する消化ベクター バックボーン帯域をカットし、1.5 mL 容マイクロ チューブ (図 1) ゲルのスライスを配置します。 商業ゲル精製キットを使用して、製造元の指示に従って agarose のゲルから DNA を抽出します。 10-15 μ L TE バッファー (10 mM トリス、pH 7.5; 10 mM トリス、pH 8.0) 集中の溶出液を取得するのに DNA を溶出します。 GRNA オリゴヌクレオチドの事前消化 pSB700 発現ベクターへのクローニングの 20 μ L 反応 (表 2) に BsmBI 消化 pSB700 ガイドの発現ベクターに手順 4 から焼鈍 gRNA オリゴヌクレオチドを縛る。 まず、水、バッファー、および DNA、そして渦混合物を追加し、酵素、酵素とソリューションのスピンダウンを追加したら 1 の最終的な時間の渦を追加 (100 x 15 g s)。室温で反応を一晩インキュベートします。 BsmBI 消化ベクトル焼なまし gRNA オリゴ インサートなし一人で否定的なコントロールのない挿入反応が含まれます。水 1 μ L は、ノー挿入のネガティブ コントロール用 gRNA オリゴヌクレオチドの 1 μ L の代わりに使用できます。 変換 (手順 9) に進みます。注: 手順 8 は predigestion の pSB700 6-7.3 の手順で説明するように別の方法です。 ゴールデン ゲートは、シングル ステップ BsmBI 制限結紮のクローニングを使用して pSB700 ベクトルに gRNA オリゴヌクレオチド (手順 1 5.1 で説明します) をご紹介します。 マスター ミックス (1 x) を組み立てる — 複数の gRNAs のクローンを作成する場合 (表 3) を追加挿入オリゴヌクレオチドなしマスター ミックスを準備します。分注マスター PCR チューブにミックスし、マルチ チャンネル ピペットを使用してステップ 4.2 から gRNA オリゴヌクレオチドを追加します。水の 1 μ L を使用してなし挿入コントロールを含めます。 な BsmBI 酵素と同じ反応で T4 DNA リガーゼ、同時制限の消化力および結紮術が達成される (すなわち、ゴールデン ゲートのクローン)。次の簡単なゲート プロトコルを使用してベクトルを消化し、1 の反応で挿入を縛る: 80 の ° C、15 分間で、15 分の 65 ° C で 10 分間に 50 ° c の 2 h の 37 ° C で反応を維持、最終的に、4 ° C でそれを保持します。 注記のうち、オリゴヌクレオチドがこのメソッドを使用する前に BsmBI サイトを含まないことを確認します。複製されている、gRNAs は、BsmBI の制限のサイトを含む場合は、BsmBI の添加によって消化されます。これにより、ユーザーが任意の形質転換体を取得できなくなります。 初期の単純なゲート反応後各反応に BsmBI 酵素の追加 0.5 μ L を追加し、55 ° C 1 時間に戻って配置します。消化力の後 4 ° C で反応を保持または変換する準備ができるまで凍結します。Religated 野生型 pSB700 ベクトルの反応混合物からバックボーン、オリゴ挿入を受けた唯一のベクトルはそのまま残ります、形質転換体を得るまたは制限の酵素培養のこの第二ラウンドが、未消化削除します。 変換 (手順 9) に進みます。 0.5 μ L の反応混合物を変換 8 μ l 中、有能なエシェリヒア属大腸菌[例えば、くちばし DH5a (1-3 109 cfu/μ g pUC19 DNA の x) またはくちばし安定 1 – 3 x 109 cfu/μ g pUC19 dna)。レンチ ウイルスのプラスミド NEB 安定細胞はより一貫性のあるプラスミッドの利回りを提供します。 -80 ° c のストレージから大腸菌を削除し、5-10 分のための氷の融解します。 有能なエシェリヒア属大腸菌の 8 μ L を反応混合物の 0.5 μ L を追加し、30 分間氷の上混合物。 熱衝撃 45 42 ° C で混合 s。 2 分間氷の上に置きます。 くちばし DH5a 37 ° C で、NEB の馬小屋のための 30 の ° C で 1 時間 250 μ L の SOC のメディアでシェーカーの文化を回復します。 適切な抗生物質耐性ホストゲノム スープ (LB) プレート上のカルチャの 80 μ L をプレートし、くちばし DH5a 37 ° C で、NEB の馬小屋のための 30 の ° C で、一晩インキュベート [例えばpSB700 でメッキされてポンドにアンピシリン (100 μ g/mL) 板] (図 3)。 GRNA 発現プラスミドのシーケンスの検証: 各コロニー サンガー、プライマー 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 を使用してシーケンスのシーケンスを確認 ‘ U6 プロモーター上流でどの素数 gRNA オリゴの挿入します。 (表 4) のシーケンス処理反応あたり 2 3 人のコロニーを拾います。注: いくつかのシーケンス プロバイダー提供サービス今はサンガーを実行できるシーケンスの前にプラスミドを浄化する必要性を排除することによって時間とコストを大幅に削減する細菌のコロニーから直接シーケンスします。また、個々 の細菌のクローンからプラスミド DNA を回復するプラスミド分離キットを使用することがあります。精製プラスミドは、シーケンスの提出可能性があります。プールの ligation の反作用を実行する場合は、ガイドとして表 4を使用して、選択および配列のために提出すべきコロニー数の。 次のシーケンス確認 gRNA 発現プラスミドを分離します。 100 μ g/mL pSB700 発現ベクターのアンピシリンを含む LB 培地 5 mL 文化に目的のコロニーを接種するのに滅菌ピペット チップを使用します。 37 ° C 一晩 (30 ° C NEB の馬小屋を使用している場合) で 100 rpm で回転のインキュベーターで細胞を成長します。 プラスミッドの準備キット、次の製造元のプロトコルを使用して文化からのプラスミッド DNA を分離します。注: 上記の方法は、単一の gRNA を含むベクトルを作成するユーザーをできるように中、このプロトコルはそれぞれ自分の RNA ポリメラーゼ III のプロモーターによって駆動される 2 の gRNAs を含むベクトルを作成するユーザーを許可します。 対 gRNA デザイン (手順 1.1 1.4) 上記 sgRNA デザイン ツールから出力ファイルを使用し、興味の 2 ガイドを選択します。 少なくとも 30 ガイドのペアを選択アクティブ化または抑圧は、nt を離れて。 切断用 gRNAs、ターゲット遺伝子内 2 異なるエクソン ガイドを選択します。 以下の手順では、gRNA の配列の最初の gRNA とペア gRNA オリゴヌクレオチド シーケンス変更を作成する配列 gRNA – b の 2 番目の gRNA を指定します。注意: gRNA A を作成するために使用するオリゴをコール、fA、および rB と呼ばれるが逆オリゴ gRNA B を紹介するために使用します。下のクローンの作成方法は、gRNAs のそれぞれの 5′ 端に開始 G を自動的に追加します。 適切な fA オリゴをとおり作成します。注: gRNA A はシーケンスをターゲット gRNA を含む 20 ヌクレオチドは、する、次の手順を (例えばprotospacer – aggggctacaccactcattg) 建設初期の fA シーケンスを構成します。 FA (例えば、シーケンス TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg の) の 5′ 末端に TTTTCGTCTCTCACCG を追加します。 FA (例えば、シーケンス TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAの) の 3′ 末端にGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAを追加します。これは注文する fA oligo の最終版です。 必要な rB オリゴをとおり作成します。注: gRNA b gRNA ターゲット シーケンスを構成する 20 のヌクレオチドはする、次の手順を (例えば、開始シーケンス gtcccctccaccccacagtg の) 建設初期の rB シーケンスを構成します。 RB の逆の補数を取る= (revcom) rB (例えばcactgtggggtggaggggac)。 (Revcom) の 5′ 端に TTTTCGTCTCTAAAC を追加 rB (e.g。、TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac)。 (Revcom) の 3’ 末端にCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAGを追加 (例えば、TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG) rB。これは注文する rB oligo の最終版です。注: oligo シーケンスを自動的に編集するのには一般的な表計算ソフトで次の数式を使用する可能性があります: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2)”GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”)、A2 は fA シーケンス、およびを含むセル =CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2)、「CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG」)B2 は (revcom) rB シーケンスを含むセル。 最適な合成ベンダーからオリゴヌクレオチドを注文します。追加の変更は必要ありません。 FA、rB のプライマーで PCR を実行するのに準備されたプラスミド DNA を使用します。これが両方の前方に接続され、このプラスミドから生成された PCR のフラグメントに逆 gRNAs はそれぞれ独自のプロモーターから発現することを許可する (U6 及び 7SK のプロモーター-異なるプロモーターは、組換えウイルスを防ぐためにこの設計で使用される)。 Phusion GC 特別な PCR のプロトコルを使用して、必要なフラグメントを作成する: 15 98 ° C で 1 分 (1 サイクル)、98 ° C で混合物を維持 15 53 ° c s s、2 分の 65 ° c と 4 分 (30 サイクル) のための 72 ° c、し、4 ° c (表 5) 押し。 1% の agarose のゲルの PCR の製品を実行し、確認その 1 バンド ~ 490 見て bp (図 2)。 カットし、選択のゲルの抽出キットを使用してこの PCR の製品を抽出します。TE バッファー (10 mM トリス、pH 7.5; 10 mM トリス、pH 8.0) の 15 μ L に DNA を溶出あるいは蒸留水します。 DNA のモル計算の分光光度計と pSB700 ベクトルのそれと一緒に抽出した製品の濃度を測定します。PCR の製品と 40 femtomoles/μ L の濃度にベクトルを正規化します。注: いくつかのウェブサイトが DNA とその濃度の長さに基づいて与えられた DNA 溶液のモル濃度の計算を支援するために利用できる (例えばPromega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols)。電卓は数式を使用してください。ここで、N は塩基配列の長さです。 PSB700 ベクトルに PCR のフラグメントをクローンするステップ 8-8.4 で説明したプロトコルを使用して同時制限消化とライゲーション反応を設定します。 プライマー溶液 1 μ L を反応に追加すると、代わりに 1 μ L の PCR の製品の 40 fmole/μ L を追加します。また、40 fmole/μ L の濃度で pSB700 ベクトルの 1 μ L を使用します。注: 正確な比率を使用されない場合でも植民地を得ることができるが、等しいのモル比は、一貫性のある結果をもたらします。 完了するとゴールデン ゲート反応プロセス (手順 8-8.4)、変換およびシーケンスの確認 (手順 9 – 10.2.3) に進みます。