CRISPR Guide RNA clonage pour systèmes mammaliens

Remarque : Le protocole suivant décrit comment effectuer la conception gRNA à l’aide des outils en ligne (étapes 1.1 à 1.4), qui sont communs à toutes les méthodes de construction de plasmide gRNA détaillées dans ce manuscrit. Une fois identifiés les gRNAs désirés, les étapes pour commander les oligonucléotides nécessaires sont décrites ainsi que différentes méthodes pour introduire les oligonucléotides dans des vecteurs d’expression (par exemple, pSB700). 2 méthodes de clonage unique vecteurs exprimant le guide basés sur chaque ligature dans un vecteur d’expression prédigérées (étapes 2-7,3) ou Golden Gate clonage (étapes 8 à 8,4) sont présentées. Décrites plus loin est une stratégie pour appariés exprimant le guide de vecteurs de clonage à l’aide de la chaîne par polymérase (PCR) suivie du Golden Gate, clonage (étapes 11 à 16). Enfin, des méthodes communes pour effectuer une transformation chimique d’e. coli (étapes 9 à 9,6) et une expression vector séquence de validation (étapes 10 à 10.2.3) sont également décrites. Concevoir des oligonucléotides gRNA à l’aide d’outils en ligne comme suit. GRNAs de conception à l’aide des outils en ligne tels que l’ outil en ligne (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/) de sgRNA buteur 2.013 ou alternatives telles que l’outil de conception large sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-conception)14 et plusieurs autres15. Utilisez le nom de gène, symbole ou brut des séquences d’ADN cible pour générer des séquences de gRNA potentiels.Remarque : Un fichier de feuille de calcul (.csv/.xls) avec tous les gRNAs potentiels contre le gène ou la séquence fournie est créé. La qualité de la gRNAs potentiels sera signalée comme Score si on utilise l’outil en ligne de sgRNA buteur 2.0 ou individualisées efficacité % si on utilise l’outil de conception de sgRNA large. Ces deux mesures sont obtenues au basée sur l’activité de découpe sur la cible. Tenir compte de l’ activité hors-cible dans la sélection gRNA classement le gRNAs.Remarque : Les guides optimales sont ceux avec la plus grande efficacité sur la cible et l’activité moins hors-cible. Pour l’activation (CRISPRa), gRNAs sont conçus pour cibler la région allant de 1 à 200 PB en amont du début de transcription site (TSS)4,15. Pour l’inhibition (CRISPRi), gRNAs sont conçus pour cibler la région de 50 PB en amont du TSS jusqu’à 300 PB en aval de la TSS5. Pour désactiver un gène à l’aide de Cas9 couper, gRNAs sont conçus pour cibler le premier 10-50 % de la séquence codante en aval de l’initiatrice de codon (comme gRNAs ciblant l’extrémité 3′ du gène auraient dû être divulgués soient moins efficaces)13. S’assurer aucune BsmBI les sites internes ne sont présents si les oligonucléotides sont utilisées pour le clonage de Golden Gate, car cela se traduira par les oligonucléotides recuits étant digéré13. Sélectionner les séquences génomiques cible et supprimer le 3′ NGG PAM (en laissant seulement la séquence de protospacer) pour la modification de séquences oligonucléotidiques gRNA unique (p. ex., séquence de démarrage : CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).Remarque : Si vous utilisez une feuille de calcul, la formule suivante va supprimer 3′ NGG : =LEFT(A2,LEN(A2)-3), où A2 est la cellule contenant la séquence cible et la PAM. Ajouter CACCG à l’extrémité 5′ de l’oligo.Remarque : Lors de la ligature à l’épine dorsale pSB700, cette séquence comprendra l’extrémité 3′ du promoteur U6 conduite la transcription de la gRNA. La séquence « CACC » garantit que les oligo est compatible avec les surplombs du vecteur pSB700 BsmBI-digéré. Le « G » est une exigence des promoteurs de la polymérase III et assure l’initiation efficace de la transcription de la gRNA. Utilisez la formule suivante dans une feuille de calcul pour effectuer cette tâche : =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), où B2 est la cellule contenant la séquence protospacer [par exemple, ajout la 5′ CACCG de séquence à le protospacer : CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (ceci est les oligo avant définitive dans l’ordonnance)]. Créer un complément inversé (rc) de la séquence protospacer.Remarque : par exemple, le complément inverse de la protospacer ci-dessus est TGGATGAGGGAGAGCACGCG. Ajouter AAAC à l’extrémité 5′ de le protospacer rc. Ajouter une C supplémentaire à l’extrémité 3′ de le protospacer rc (oligo inverse).Remarque : La séquence « AAAC » garantit que les oligo est compatible pour le clonage dans le vecteur pSB700 BsmBI-digéré. Le « C » supplémentaire sur l’extrémité 3′ est nécessaire de recuire la séquence à la responsable « G » ajouté à l’oligo avant. Utiliser la formule suivante dans une feuille de calcul pour effectuer cette tâche =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), où C2 est la cellule qui contient la séquence inverse complément [par exemple, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (c’est la finale oligo inverse qui est commander)]. Commander les oligonucléotides, sans aucune modification supplémentaire sur les oligonucléotides. Commander la quantité minimale d’oligo requis, que seules de très petites quantités sont nécessaires pour les réactions de clonage. Diluer les amorces lyophilisés à une concentration finale de 100 μM à 1 x tampon TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 avec EDTA 1 mM). Aliquotes 1:1 et inverses oligonucléotides (p. ex., 10 μL de chaque) dans des bandes-tubes PCR.Remarque : Ceci permettra le clonage rapide de nombreux gRNAs à la fois à l’aide d’une pipette multicanaux. Vortex et spin down les mélanges oligo (100 x g pendant 15 s). Incubez la réaction à température ambiante pendant 5 min avant de configurer la ligature.Remarque : Il n’est pas nécessaire chauffer et refroidir les mélanges oligo pour faciliter leur recuit. Il est à noter que 3-4 paires d’oligonucléotides gRNA peuvent être mis en commun et recuits en une seule réaction (par exemple, mélange 3 μL de vers l’avant et 3 μL d’inverser oligonucléotides ensemble de jusqu’à 4 paires d’oligo gRNA, ce qui donne un volume total de 24 μL). Le volume des oligonucléotides utilisé pour le recuit peut être ajusté pour répondre aux besoins de l’utilisateur.Remarque : Les étapes 6-7.3 décrivent la predigestion de pSB700. Pour une autre méthode, reportez-vous à l’étape 8, qui décrit une seule étape BsmBI restriction des trompes. Digérer les 1-5 μg du vecteur d’expression guide sélectionné pSB700 avec BsmBI (0,5 μL / 1 μg) pendant 1 h à 55 ° C15. Effectuer la digestion du vecteur pSB700 gRNA expression dans un volume total de 40 μL (tableau 1). Exécuter les produits de digestion sur gel d’agarose à bas point de fusion 1,5 % (wt/vol). Découper la bande d’épine dorsale vector digérées qui correspond à un fragment de ~ 9 kb en taille et placez la tranche de gel dans un tube de microtubes de 1,5 mL (Figure 1). Un kit de purification de gel commercial permet d’extraire l’ADN du gel d’agarose selon les instructions du fabricant. Éluer l’ADN dans 10-15 μL de tampon TE (10 mM Tris, pH 7,5 ; 10 mM Tris, pH 8,0) pour obtenir un concentré éluat. Ligaturer les oligonucléotides gRNA recuit de l’étape 4 dans le vecteur d’expression guide pSB700 BsmBI-digéré dans une réaction de 20 μL (tableau 2) pour le clonage des oligonucléotides gRNA dans le vecteur d’expression pSB700 prédigéré. Tout d’abord, ajouter l’eau, tampon et ADN, puis vortex le mélange et enzyme, vortex 1 fois final après l’ajout de l’enzyme et la Centrifuger la solution (100 x g pendant 15 s). Incuber les réactions à la température ambiante jusqu’au lendemain. Inclure une réaction de contrôle négatif non-insert qui a un vecteur digérés BsmBI seul, sans un gRNA recuit oligo insert. 1 μL d’eau peut être utilisé à la place de la 1 μL d’oligonucléotides gRNA du contrôle négatif non-insert. Procéder à la transformation (étape 9).Note : Étape 8 est une méthode alternative à la predigestion de pSB700 comme décrit aux étapes 6-7.3. Introduire les oligonucléotides gRNA (décrites aux étapes 1-5.1) dans le vecteur pSB700 grâce à l’utilisation de Golden Gate clonage pour la ligature de restriction de BsmBI seule étape. Assembler les master mix (1 x) — si gRNAs multiples sont être clonés, préparer le mélange maître sans les oligonucléotides insert ajoutés (tableau 3). Aliquot le capitaine mélanger dans des tubes PCR et utiliser une pipette multicanaux pour ajouter les oligonucléotides gRNA d’étape 4.2. Inclure un contrôle non-insert à l’aide de 1 μl d’eau. En incluant les enzymes BsmBI et T4 DNA ligase au sein de la même réaction, la digestion simultanée de restriction et ligature sont atteints (c.-à-d., Golden Gate clonage). Utiliser le protocole de porte Simple suivant pour digérer le vecteur et ligaturer les inserts dans 1 réaction : garder la réaction à 37 ° C pendant 2 h, à 50 ° C pendant 10 min, à 65 ° C pendant 15 min, à 80 ° C pendant 15 min et enfin , tenez-le à 4 ° C. À noter, vérifier que les oligonucléotides ne contiennent pas de sites de BsmBI avant d’utiliser cette méthode. Si les gRNAs être clonés contiennent des sites de restriction de BsmBI, ils vont être digérés lors de l’addition de BsmBI. Cela empêche l’utilisateur d’obtenir des transformants. Après la réaction initiale de porte Simple, ajouter une supplémentaire μL 0,5 de BsmBI enzyme à chaque réaction et placez-les à 55 ° C pendant 1 h. Après la digestion, maintenir la réaction à 4 ° C ou congelez-la jusqu’au moment de transformer. Ce second tour de l’incubation de l’enzyme de restriction supprime tout non digérés ou religaturé sauvage pSB700 vecteur colonne vertébrale du mélange réactionnel afin que seuls vecteurs qui ont reçu les inserts oligo restent intactes et donneront des transformants. Procéder à la transformation (étape 9). Transformer les 0,5 μl du mélange réactionnel en 8 μL de compétentes d’ Escherichia coli [p. ex., NEB, DH5a (1-3 x 109 UFC/µg d’ADN de pUC19) ou NEB Stable 1 – 3 x 109 UFC/µg d’ADN de pUC19). Pour les plasmides des gènes, cellules stables NEB fournira plus cohérente des rendements de plasmide. Supprimer les e. coli de stockage à-80 ° C et Décongelez-le sur glace pendant 5-10 min. Ajouter 0,5 μl du mélange réaction à 8 μL de compétentes d’ Escherichia coli et garder le mélange sur la glace pendant 30 min. Chaleur de choc le mélange à 42 ° C pendant 45 s. Posez-la sur la glace pendant 2 min. Récupérer la culture sur un agitateur rotatif dans 250 μL de médias SOC pendant 1 h à 37 ° C pendant NEB DH5a et à 30 ° C pour les écuries de l’ONÉ. Plaque de 80 μL de la culture sur une résistance aux antibiotiques appropriée lysogénie bouillon (LB) plaque et incuber durant une nuit à 37 ° C pendant NEB DH5a et à 30 ° C pour les écuries de l’ONÉ [par exemple, pSB700 est plaqué sur LB avec plaques d’ampicilline (100 μg/mL)] (Figure 3). Valider la séquence du plasmide expression gRNA : vérifier la séquence de chaque colonie par Sanger sequencing à l’aide de l’apprêt 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ quels nombres premiers au promoteur U6 en amont de l’oligo gRNA insérer. Prélever des colonies de 2-3 par la réaction de séquençage (tableau 4).Remarque : Plusieurs fournisseurs de séquençage maintenant offre des services qui peuvent exécuter Sanger sequencing directement à partir de colonies bactériennes, ce qui réduit considérablement les temps et les coûts en éliminant le besoin de purifier les plasmides avant séquençage. Par ailleurs, un kit d’isolation de plasmide peut servir à récupérer l’ADN plasmidique des clones bactériens individuels. Plasmides purifiés peuvent alors être soumises pour le séquençage. Si une réaction de mise en commun de la ligature est exécutée, utilisez tableau 4 comme un guide pour le nombre de colonies qui devraient être sélectionnés et présentés pour le séquençage. Après la confirmation par séquence, isoler les plasmides d’expression gRNA. Utiliser un embout de la pipette stérile pour inoculer la colonie voulue en une culture de 5 mL de milieu LB contenant 100 μg/mL d’ampicilline pour vecteurs d’expression pSB700. Cultiver les cellules dans un incubateur rotatif à 100 tr/min à 37 ° C pendant la nuit (30 ° C si ONÉ écuries sont utilisés). Isoler l’ADN de plasmide issus des cultures à l’aide d’un kit de préparation de plasmide, suivant le protocole du fabricant.Remarque : Même si les méthodes ci-dessus permettent aux utilisateurs de créer de simples vecteurs contenant gRNA, ce protocole permettra aux utilisateurs de créer des vecteurs qui contiennent 2 gRNAs, chacune entraînée par son propre promoteur III de RNA polymérase. Pour une conception gRNA appariés, utiliser le fichier de sortie dans les outils de conception de sgRNA décrites ci-dessus (étapes 1.1 à 1.4), puis sélectionnez 2 guides d’intérêt. Pour une activation ou de la répression, sélectionnez paires de guides qui sont au moins 30 nt dehors. Pour gRNAs utilisé pour la coupe, sélectionnez guides qui ciblent les 2 différents exons du gène. Pour les instructions qui suivent, de désigner le premier gRNA dans le tableau gRNA-A et le deuxième gRNA dans le tableau gRNA-B, pour créer une modification de séquences oligonucléotidiques gRNA appariés.Remarque : Les oligo utilisé pour créer gRNA-a s’appellera fA, et les oligo inverse utilisé pour introduire gRNA-B sera dénommé rB. La méthode de clonage ci-dessous ajoute automatiquement un G initial à l’extrémité 5′ de chacune du gRNAs. Créez les oligo fA approprié comme suit.Note : Les 20 nucléotides comprenant le gRNA ciblant la séquence pour gRNA-A volonté constituent la séquence de fA initiale sur laquelle les étapes suivantes seront appuiera (p. ex., protospacer – aggggctacaccactcattg). Ajouter TTTTCGTCTCTCACCG à l’extrémité 5′ de fA (par exemple, de la séquence de TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg). Ajouter GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA à l’extrémité 3′ de fA (par exemple, de la séquence TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Il s’agit de la version finale de la fA oligo qui seront commandé. Créez les oligo rB nécessaire comme suit.Remarque : Les 20 nucléotides comportant la séquence de ciblage gRNA pour gRNA-B constituera la séquence initiale de rB sur lesquels les étapes suivantes seront appuiera (par exemple, de le gtcccctccaccccacagtg départ de séquence). Prendre le complément inverse de rB = (revcom) rB (p. ex., cactgtggggtggaggggac). Ajouter TTTTCGTCTCTAAAC à l’extrémité 5′ de (revcom) rB (e.g., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). Ajouter CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG à l’extrémité 3′ de (revcom) rB (p. ex., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Il s’agit de la version finale de l’oligo rB qui seront commandé.Remarque : les formules suivantes peuvent être utilisés avec un logiciel tableur commun pour modifier automatiquement les séquences oligo : = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), « GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA »), où A2 est la cellule qui contient la séquence de la fA et = Concatenate(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2), » CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG »), où B2 est la cellule qui contient la séquence de rB (revcom). Commander les oligonucléotides auprès d’un fournisseur de synthèse de choix. Aucune modifications supplémentaires ne sont nécessaires. L’ADN de plasmide préparé permet d’effectuer des PCR avec des amorces de fA et de rB. Il s’attache les deux vers l’avant et l’inverses gRNAs au fragment PCR produit de ce plasmide et volonté permettre à chacun de s’exprimer depuis son propre promoteur (promoteurs U6 et 7SK — des promoteurs différents sont utilisés dans cette conception pour empêcher une recombinaison virale). Le protocole de PCR spécial Phusion GC permet de créer le fragment nécessaire : garder le mélange à 98 ° C pendant 1 min (1 cycle), à 98 ° C pendant 15 s, à 53 ° C pendant 15 s, à 65 ° C pendant 2 min et à 72 ° C pendant 4 min (30 cycles) , puis maintenez-le à 4 ° C (tableau 5). Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % et vérifier que la 1 bande est visible à ~ 490 bp (Figure 2). Couper et extraire ce produit de la PCR en utilisant un gel extraction kit de choix. Éluer l’ADN dans 15 μL de tampon TE (10 mM Tris, pH 7,5 ; 10 mM Tris, pH 8,0) ou de l’eau distillée. Mesurer la concentration du produit extrait ainsi que celle du vecteur pSB700 avec un spectrophotomètre pour le calcul de molarité de l’ADN. Normaliser le produit de la PCR et le vecteur à une concentration de 40 femtomoles/μL.Remarque : Plusieurs sites Internet est disponibles pour aider avec le calcul de la molarité d’une solution d’ADN donnée basée sur la longueur de l’ADN et sa concentration en solution (par exemple, Promega : http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Le calculateur utilise la formule :Ici, N est la longueur de la séquence nucléotidique. Mettre en place une réaction de digestion et ligature restriction simultanées utilisant le protocole décrit aux étapes 8-8,4 pour cloner le fragment PCR dans un vecteur de pSB700. Au lieu d’ajouter 1 μL de solution d’amorce de la réaction, ajouter 1 μL de 40 fmole/μl du produit PCR. En outre, utiliser 1 μL du vecteur pSB700 à une concentration de 40 fmole/μL.Remarque : Rapports molaires égales conduisent à des résultats conformes, même si même dans les cas où les rapports exacts ne sont pas utilisés, les colonies peuvent être obtenus. Après avoir terminé le processus de réaction du Golden Gate (étapes 8-8.4), procéder à la vérification de séquence et de la transformation (étapes 9 – 10.2.3).