كريسبر دليل الحمض النووي الريبي استنساخ الثدييات بالأنظمة

ملاحظة: يحدد البروتوكول التالية كيفية تنفيذ تصميم جرنة باستخدام أدوات الإنترنت (الخطوات 1، 1، 1-4)، التي مشتركة بين جميع أساليب البناء بلازميد جرنة بالتفصيل في هذه المخطوطة. حالما يتم تحديد جرناس المطلوب، يتم وصف الخطوات لترتيب النوكليوتيد اللازمة جنبا إلى جنب مع العديد من الطرق المختلفة لإدخال النوكليوتيد في ناقلات التعبير (مثلاً، pSB700). عرض طرق 2 لاستنساخ ناقلات معربا عن دليل واحد على أساس أما ربط إلى ناقل تعبير مهضوم (الخطوات 2-7.3) أو البوابة الذهبية الاستنساخ (الخطوات 8-8.4). كذلك المبين استراتيجية لناقلات التعبير عن دليل مقترن بالاستنساخ باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تليها البوابة الذهبية الاستنساخ (الخطوات 11-16). وأخيراً، يرد أيضا الأساليب الشائعة للقيام تحول الكيميائي كولاي (الخطوات 9-9.6) وتعبير ناقلات التحقق من تسلسل (الخطوات 10 إلى 10.2.3). تصميم النوكليوتيد جرنة باستخدام أدوات الإنترنت كما يلي. جرناس التصميم باستخدام أدوات الإنترنت مثل أداة على الإنترنت (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/) سجرنا 2.0 هداف13 أو البدائل مثل أداة تصميم سجرنا واسعة (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ سجرنا-تصميم)14 والعديد غيرها15. استخدم اسم الجينات، الرمز، أو تسلسل الهدف الحمض الخام لتوليد متواليات جرنة المحتملة.ملاحظة: يتم إنشاء ملف جدول بيانات (.csv/.xls) مع كل جرناس المحتملة ضد الجينات أو تسلسل المقدمة. وستبلغ جودة جرناس المحتملة نقاط في حالة استخدام هذه الأداة على الإنترنت سجرنا 2.0 هداف أو % على الكفاءة المستهدفة إذا يتم استخدام أداة تصميم سجرنا واسع النطاق. يتم اشتقاق كل التدابير في استناداً إلى نشاط قطع على الهدف. تنظر النشاط المستهدف في اختيار جرنة عند ترتيب جرناس.ملاحظة: أدلة المثلى تلك مع أكبر قدر من الكفاءة في الهدف والنشاط الأقل خارج الهدف. التنشيط (كريسبرا)، جرناس المصممة لاستهداف المنطقة من 1-200 bp المنبع ابدأ النسخي4،موقع (TSS)15. لتثبيط (كريسبري)، تم تصميم جرناس لاستهداف المنطقة من 50 شركة بريتيش بتروليوم المنبع لخدمات الدعم التقني حتى 300 bp المصب المرفق5. لتعطيل جين باستخدام قطع Cas9، صممت جرناس لاستهداف أول 10-50% من تسلسل الترميز المصب كودون (كاستهداف جرناس 3 ‘ نهاية الجين قد أظهرت أن تكون أقل فعالية) بدء13. التأكد من لا مواقع بسمبي الداخلية الحالية إذا النوكليوتيد المستخدمة لاستنساخ البوابة الذهبية، كما سيؤدي هذا النوكليوتيد ملدنة يجري هضمها13. حدد تسلسل الجينوم المستهدفة وإزالة 3 ‘ نج بام (ترك التسلسل بروتوسباسير فقط) لتعديل تسلسل اليغنوكليوتيد جرنة واحد (مثلاً، يبدأ التسلسل: كجكجتجكتكتكككتكاتككاتج).ملاحظة: إذا كان استخدام جدول بيانات، سيتم إزالة الصيغة التالية 3 ‘ نج: =LEFT(A2,LEN(A2)-3)، حيث هو A2 الخلية التي تحتوي على تسلسل المستهدفة بام. إلحاق كاككج إلى نهاية 5 ‘ اليغو.ملاحظة: عند ربط للعمود الفقري pSB700، سيضم هذا التسلسل 3 ‘ نهاية المروج U6 يقود النسخ من جرنة. يضمن التسلسل “كاكك” متوافقة مع يتدلى ناقلات هضمها بسمبي pSB700 اليغو. “G” هو شرط للمروجين “الثالث بوليميريز” ويضمن بدء نسخ جرنة كفاءة. تستخدم الصيغة التالية في جدول بيانات للقيام بهذه المهمة: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2))، حيث هو B2 الخلية التي تحتوي على تسلسل بروتوسباسير [مثلاً، إضافة 5 ‘ كاككج تسلسل إلى بروتوسباسير: كاككجكجكجتجكتكتكككتكاتككا (وهذا هو اليغو الأمام النهائية التي يتم طلبها)]. إنشاء تكملة عكس التسلسل بروتوسباسير (اتفاقية روتردام).ملاحظة: على سبيل المثال، عكس تكمل بروتوسباسير المذكور أعلاه هو تجاتجاججاجاجكاكجكج. قم بإلحاق AAAC 5 ‘ نهاية بروتوسباسير اتفاقية روتردام. قم بإلحاق ج إضافية نهاية 3 ‘ بروتوسباسير اتفاقية روتردام (عكس اليغو).ملاحظة: تسلسل “آآك” يضمن اليغو متوافقة للاستنساخ في ناقلات هضمها بسمبي pSB700. “ج” إضافية في نهاية 3 ‘مطلوب يصلب التسلسل لبدء”G” إضافة إلى اليغو إلى الأمام. استخدام الصيغة التالية في جدول بيانات القيام بهذه المهمة =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”)، حيث C2 هي الخلية التي تحتوي على تسلسل تكملة عكس [مثلاً، آآكتجاتجاججاجاجكاكجكجك (هذا هو اليغو عكس النهائي هو أمرت)]. تأمر النوكليوتيد، مع لا تعديلات إضافية على النوكليوتيد. نظام الحد الأدنى من اليغو المطلوبة، كما هناك حاجة إلى كميات صغيرة جداً فقط لردود فعل الاستنساخ. تمييع الإشعال المجففة بالتبريد بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر في 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس Cl، درجة الحموضة 7.5 مع 1 مم يدتا). الكوة 1:1 إلى الأمام وعكس النوكليوتيد (مثلاً، 10 ميكروليتر كل) إلى بكر الحد الأقصى لقطاع الأنابيب.ملاحظة: هذا سوف يسمح السريع استنساخ العديد من جرناس في وقت باستخدام ماصة الأقنية. دوامة وتدور أسفل الخلائط اليغو (ز 100 x لمدة 15 ثانية). تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل إعداد الربط.ملاحظة: ليس الضرورية الحرارة وبارد ثم الخلائط اليغو تيسيرا على الصلب. تجدر الإشارة إلى أنه قد تجمع 3-4 أزواج من النوكليوتيد جرنة وتعتيق في رد فعل واحد (مثلاً، ميكروليتر ميكس 3 إلى الأمام وميكروليتر 3 من عكس النوكليوتيد معا من يصل إلى 4 أزواج اليغو جرنة، إعطاء إجمالي حجم 24 ميكروليتر). يمكن تعديل حجم النوكليوتيد المستخدمة للصلب لاستيعاب احتياجات المستخدم.ملاحظة: تصف الخطوات 6-7.3 بريديجيسشن pSB700. للحصول على أسلوب بديل، راجع الخطوة 8، الذي يصف ربط قيد بسمبي خطوة واحدة. هضم 1-5 ميكروغرام من ناقلات التعبير الدليل المحدد pSB700 مع بسمبي (ميكروليتر 0.5 الواحدة 1 ميكروغرام) ح 1 في15من 55 درجة مئوية. إجراء عملية هضم ناقلات التعبير جرنة pSB700 في إجمالي حجم 40 ميكروليتر (الجدول 1). تشغيل منتجات الهضم على 1.5% (wt/المجلد) ذوبان منخفضة [اغروس] هلام. قطع الفرقة هضمها ناقلات العمود الفقري الذي يتوافق مع جزء من ~ 9 كيلو بايت في الحجم، ومكان الشريحة جل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل (الشكل 1). استخدام أدوات تنقية جل تجاري لاستخراج الحمض النووي من [اغروس] هلام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. الوت الحمض النووي إلى 10-15 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ 10 مم تريس، pH 8.0) للحصول على النذرة مركزة. سد النوكليوتيد جرنا الملدنة من الخطوة 4 إلى ناقل التعبير دليل هضمها بسمبي pSB700 في رد فعل 20 ميكروليتر (الجدول 2) لاستنساخ النوكليوتيد جرنا إلى ناقل التعبير pSB700 ما قبل هضمها. أولاً، إضافة الماء، المخزن المؤقت، والحمض النووي، ثم دوامة الخليط وإضافة الإنزيم، دوامة 1 الوقت النهائي بعد إضافة الإنزيم وتدور أسفل الحل (ز 100 x لمدة 15 ثانية). احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. وتشمل فعل مراقبة سلبية لا إدراج يحتوي على ناقل هضمها بسمبي وحدها، دون إدراج اليغو جرنا ملدنة. يمكن استخدام 1 ميكروليتر من المياه بدلاً من 1 ميكروليتر من النوكليوتيد جرنة للا إدراج عنصر التحكم السلبي. المضي قدما في تحويل (الخطوة رقم 9).ملاحظة: الخطوة 8 أسلوب بديل بريديجيسشن pSB700 كما هو موضح في الخطوات 7، 6-3. إدخال النوكليوتيد جرنة (الموضحة في الخطوات 1-5.1) إلى ناقل pSB700 عن طريق استخدام استنساخ البوابة الذهبية لربط القيد بسمبي خطوة واحدة. تجميع مزيج الرئيسي (س 1) — إذا كان يتم يتم استنساخ جرناس متعددة، إعداد مزيج الرئيسي دون إدراج النوكليوتيد المضافة (الجدول 3). الكوة سيد مزيج في أنابيب PCR واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة النوكليوتيد جرنة من الخطوة 4، 2. تضمين عنصر تحكم لا إدراج استخدام 1 ميكروليتر من المياه. بما فيها الإنزيم بسمبي وليجاسي T4 الحمض النووي داخل نفس رد الفعل، والهضم تقييد المتزامنة وربط تتحقق (أياستنساخ البوابة الذهبية). باستخدام بروتوكول “بوابة البسيطة” التالية لهضم الناقل واضطر يدرج في الرد 1: الحفاظ على رد الفعل في 37 درجة مئوية ح 2، عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وأخيراً ، أنه عقد في 4 درجات مئوية. من المذكرة، تحقق من أن النوكليوتيد لا تحتوي على مواقع بسمبي قبل استخدام هذا الأسلوب. إذا احتوت على جرناس التي هي يجري استنساخ بسمبي تقييد مواقع، أنهم سوف يهضم عند إضافة بسمبي. وهذا سوف يمنع المستخدم من الحصول على أي ترانسفورمانتس. بعد رد الفعل الأولى “بوابة بسيطة”، إضافة ميكروليتر 0.5 إضافية لأنزيم بسمبي لكل رد فعل ووضعها مرة أخرى في 55 درجة مئوية ح 1. بعد الهضم، عقد في رد فعل على 4 درجة مئوية أو تجميدها حتى على استعداد لتحويل. هذه الجولة الثانية من حضانة إنزيم التقييد يزيل أي عسر الهضم أو ريليجاتيد البرية من نوع pSB700 ناقلات العمود الفقري من خليط رد فعل حيث أن الناقلة الوحيدة التي تلقت إدراج اليغو تظل على حالها، وسوف تسفر عن ترانسفورمانتس. المضي قدما في تحويل (الخطوة رقم 9). تحويل ميكروليتر 0.5 من خليط رد فعل إلى 8 ميكروليتر من المختصة كولاي [مثلاً، NEB DH5a (1-3 × 109 زيمبابوي/ميكروغرام من الحمض النووي pUC19) أو NEB مستقرة 1-3 × 109 زيمبابوي/ميكروغرام من الحمض النووي pUC19). البلازميدات لينتيفيرال، سيوفر خلايا مستقرة NEB أكثر اتساقا بلازميد الغلال. إزالة كولاي من مخزن في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد من على الجليد لمدة 5-10 دقائق. إضافة 0.5 ميكروليتر من مزيج رد فعل إلى 8 ميكروليتر من المختصة كولاي والحفاظ على الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدمة الحرارة المخلوط في 42 درجة مئوية ل 45 ثانية. ثم ضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة. استعادة الثقافة في شاكر روتاري في 250 ميكروليتر من وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب ح 1 في 37 درجة مئوية ل NEB DH5a وعند 30 درجة مئوية لإسطبلات NEB. لوحة 80 ميكروليتر من الثقافة في مقاومة المضادات الحيوية مناسبة لوحة ليسوجيني مرق (رطل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ل NEB DH5a وعند 30 درجة مئوية لإسطبلات NEB [مثلاً، pSB700 هو مطلي على رطل مع لوحات الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل)] (الشكل 3). التحقق من صحة تسلسل جرنة التعبير بلازميد: التحقق من تسلسل كل مستعمرة من سانغر التسلسل باستخدام التمهيدي 5 ‘-جاججككتاتتكككاتجاتكك-3’ الذي يعبي في المروج U6 المنبع من اليغو جرنة إدراج. اختيار المستعمرات 2-3 كل رد فعل للتسلسل (الجدول 4).ملاحظة: يمكن تنفيذ العديد من موفري التسلسل الآن عرض الخدمات التي سانغر التسلسل مباشرة من المستعمرات البكتيرية، مما يقلل كثيرا من الوقت والتكاليف من خلال القضاء على الحاجة إلى تنقية والبلازميدات قبل التسلسل. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مجموعة عزل بلازميد استرداد بلازميد الحمض النووي من المستنسخين البكتيرية الفردية. ثم يمكن تقديم والبلازميدات المنقي لتسلسلها. إذا كان يتم تنفيذ فعل ربط مجمعة، استخدم الجدول 4 كدليل لعدد المستعمرات التي ينبغي تحديدها والمقدمة للتسلسل. وبعد تأكيد تسلسل، عزل والبلازميدات التعبير جرنة. استخدام تلميح ماصة معقمة لتطعيم مستعمرة المنشود في ثقافة مل 5 رطل المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين لناقلات التعبير pSB700. تنمو الخلايا في حاضنة روتاري 100 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (30 درجة مئوية إذا كانت مستخدمة إسطبلات NEB). عزل بلازميد الحمض النووي من الثقافات استخدام عدة بلازميد الإعدادية، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.ملاحظة: بينما الأساليب المذكورة أعلاه تمكين المستخدمين من إنشاء ناقلات المحتوية على جرنة واحد، هذا البروتوكول سيتم السماح للمستخدمين بإنشاء المتجهات التي تحتوي على جرناس 2، بعضها مدفوعا بالمروج الثالث بوليميراز الرنا الخاصة بهم. لتصميم جرنة المزدوجة، استخدم ملف الإخراج من أدوات التصميم سجرنا المبينة أعلاه (الخطوات 1، 1، 1-4) وحدد أدلة 2 من الفائدة. للتنشيط أو القمع، حدد أزواج من الأدلة التي هي على الأقل 30 nt أربا. جرناس المستخدمة لقطع، تحديد الأدلة التي تستهدف 2 exons مختلفة داخل الجينات. للإرشادات أدناه، أن يعين جرنة الأول في الصفيف، جرنة وجرنة الثاني في صفيف جرنة-ب، لإنشاء تعديل تسلسل اليغنوكليوتيد جرنة المزدوجة.ملاحظة: سوف يطلق اليغو المستخدمة لإنشاء جرنة من اتحاد كرة القدم، واليغو العكسية تستخدم لإدخال جرنة-ب وسوف يشار إليها باسم الميزانية العادية. الأسلوب الاستنساخ أدناه يقوم تلقائياً بإلحاق ز المبادر في نهاية 5 ‘ كل من جرناس. إنشاء اليغو fA المناسبة كما يلي.ملاحظة: تشكل النيوكليوتيدات 20 تتألف من جرنة استهداف تسلسل لإرادة جرنة-أ تسلسل فا الأولى التي ستبني الخطوات التالية (مثلاً، بروتوسباسير-أجججكتاكاككاكتكاتج). إلحاق تتتكجتكتكتكاككج إلى النهاية 5 ‘ لكرة القدم (مثلاً، في التسلسل تتتكجتكتكتكاككجاجججكتاكاككاكتكاتج). إلحاق جتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا إلى النهاية 3 ‘ لكرة القدم (مثلاً، في التسلسل تتتكجتكتكتكاككجاجججكتاكاككاكتكاتججتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا). هذا هو الإصدار النهائي من اليغو اتحاد كرة القدم التي سيتم طلبها. إنشاء اليغو rB اللازمة كما يلي.ملاحظة: سوف تشكل النيوكليوتيدات 20 تتألف من تسلسل استهداف جرنة جرنة-ب التسلسل الميزانية العادية الأولى التي ستبني الخطوات التالية (مثلاً، من جتككككتككاككككاكاجتج تسلسل البداية). أن تكمل عكس الميزانية العادية = (ريفكوم) م ع (مثلاً، كاكتجتجججتجاجججاك). إلحاق تتتكجتكتكتااك إلى نهاية 5 ‘ (ريفكوم) الميزانية العادية (على سبيل المثال., تتتكجتكتكتااككاكتجتجججتجاجججاك). إلحاق كجتجاكككاجكجكجكاكاج إلى نهاية 3 ‘ (ريفكوم) م ع (مثلاً، تتتكجتكتكتااككاكتجتجججتجاجججاككجتجاكككاجكجكجكاكاج). هذا هو الإصدار النهائي من اليغو الميزانية العادية التي سيتم طلبها.ملاحظة: يمكن استخدام الصيغ التالية مع برنامج جداول البيانات المشتركة لتحرير تلقائياً في تسلسل اليغو: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2)، “جتتتاجاجكتاتجكتجاااجكا”)، حيث A2 هي الخلية التي تحتوي على تسلسل اتحاد كرة القدم، و = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2)، “كجتجاكككاجكجكجكاكاج”)، حيث B2 الخلية التي تحتوي على تسلسل الميزانية العادية (ريفكوم). تأمر النوكليوتيد من مورد توليف للاختيار. لا تعديلات إضافية مطلوبة. استخدام بلازميد استعداد الحمض النووي لإجراء PCR مع الإشعال اتحاد كرة القدم والممولة من الميزانية العادية. هذا وسوف نعلق على حد سواء إلى الأمام وجرناس عكس إلى [بكر] جزء المتولدة من هذا بلازميد وسوف تسمح لكل منهما أن يعبر من تلقاء المروج (المروجين U6 و 7SK – المروجين مختلفة تستخدم في هذا التصميم لمنع جزئ فيروسي). استخدام “بروتوكول بكر فوسيون GC الخاصة” لإنشاء الجزء المطلوب: إبقاء الخليط عند 98 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (المرحلة 1)، عند 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، في 53 درجة مئوية لمدة 15 s، 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وإلى 72 درجة مئوية لمدة 4 دقائق (30 دورة) ، ثم اضغط عليه عند 4 درجة مئوية (الجدول 5). تشغيل المنتج بكر على 1% [اغروس] هلام والتحقق من أن الفرقة 1 ينظر في ~ 490 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 2). قص واستخراج هذا المنتج PCR باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام الاختيار. الوت الحمض النووي في 15 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس، درجة الحموضة 7.5؛ 10 مم تريس، pH 8.0) أو ماء مقطر. قياس تركيز المنتج المستخرج جنبا إلى جنب مع ناقل pSB700 مع جهاز المطياف الضوئي لحساب molarity الحمض النووي. تطبيع المنتج بكر ومتجه إلى تركيز 40 فيمتوموليس/ميكروليتر.ملاحظة: تتوفر العديد من المواقع للمساعدة في حساب molarity حل الحمض النووي معين استناداً إلى طول الحمض النووي وتركيزها في الحل (مثلاً، بروميجا: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). آلة حاسبة تستخدم الصيغة:وهنا، N هو طول تسلسل النوكليوتيدات. إعداد تقييد متزامنة الهضم ربط فعل واستخدام بروتوكول الموضحة في الخطوات 8-8.4 إلى استنساخ جزء بكر إلى ناقل pSB700. بدلاً من إضافة 1 ميكروليتر من حل التمهيدي إلى رد فعل، إضافة 1 ميكروليتر من 40 فمولي/ميكروليتر من المنتج PCR. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم ميكروليتر 1 ناقل pSB700 بتركيز 40 فمولي/ميكروليتر.ملاحظة: نسب المولى المساواة تؤدي إلى نتائج متسقة، على الرغم من أن حتى في الحالات التي لا تستخدم فيها النسب الدقيقة، ويمكن الحصول على المستعمرات. عند الانتهاء من عملية رد فعل البوابة الذهبية (الخطوات 8-8.4)، المضي قدما بالتحول وتسلسل التحقق (الخطوات من 9-10.2.3).