ТРИФОСФАТЫ руководство РНК клонирования млекопитающих систем

Примечание: Следующий протокол описывается, как выполнять gRNA дизайн с помощью онлайн-инструментов (шаги 1.1-1.4), которые являются общими для всех методов строительства gRNA плазмида, подробно изложены в этой рукописи. После того, как желаемый оформления определены, наряду с несколько различных методов для введения олигонуклеотиды в векторы выражения (например, pSB700) описаны шаги для заказа необходимых олигонуклеотиды. Представлены 2 методы для клонирования единичных векторов выражения руководство на основе либо перевязка в predigested выражение вектор (шаги 2-7.3) или Золотые ворота клонирования (шаги 8-8.4). Далее приводится стратегия для клонирования парных Путеводитель выражая векторов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) следуют Золотые ворота клонирования (шаги 11-16). Наконец также изложены общие методы для выполнения химической трансформации E. coli (шаги 9-9,6) и вектора выражения последовательности проверки (шаги 10 до 10.2.3). Дизайн gRNA олигонуклеотиды с использованием онлайновых инструментов следующим образом. Дизайн оформления с помощью онлайн инструменты, такие как sgRNA бомбардиром 2.0 онлайн-инструмент (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 или альтернативы, такие как средство проектирования широкого sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna дизайн)14 и несколько других15. Используйте для создания потенциальных gRNA последовательностей гена имя, символ или сырой последовательности ДНК.Примечание: Создается файл электронной таблицы (.csv/.xls) со всех потенциальных оформления против ген или предоставленной последовательности. Качество оформления потенциальных будет сообщено как Оценка , если используются sgRNA бомбардиром 2.0 онлайн-инструмент, или как % целевой эффективности если используется средство проектирования широкого sgRNA. Обе эти меры являются производными на основе деятельности на цели резки. Рассмотрим деятельность – целевой в выборе gRNA при ранжировании оформления.Примечание: Оптимального руководства являются те, с наибольшей эффективностью на цель и наименее-целевого действия. Для активации (CRISPRa) оформления предназначены для целевой регион от 1-200 bp, вверх по течению transcriptional начало сайта (TSS)4,15. Для ингибирования (CRISPRi), оформления предназначены для целевой регион от 50 bp вверх по течению ТВУ до 300 bp по течению ТП5. Чтобы отключить гена с помощью Cas9 резки, оформления предназначены для целевой первый 10-50% кодирования последовательности по течению инициирующей кодон (как оформления ориентации 3′ конца гена показали менее эффективными)13. Обеспечение не внутренние сайты BsmBI присутствуют если олигонуклеотиды используется для клонирования, Золотые ворота, поскольку это приведет к отожженная олигонуклеотиды, переваривается13. Выберите геномные последовательности и удалить 3′ NGG PAM (оставляя только последовательность protospacer) для изменения последовательности олигонуклеотида одного gRNA (например, начиная последовательность: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).Примечание: При использовании таблицы, следующая формула будет удалить 3′ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), где ячейка A2 содержит последовательности целевых объектов и Пэм. Добавьте CACCG к 5′ концу oligo.Примечание: После перевязки pSB700 магистрали, эта последовательность будет состоять из 3′ конца промотор U6, вождение транскрипции gRNA. Последовательность «CACC» гарантирует, что oligo совместим с свесы переваривается BsmBI pSB700 вектора. «G» является требованием полимеразы III промоутеров и обеспечивает эффективное инициации транскрипции gRNA. Используйте следующую формулу в электронной таблице для выполнения этой задачи: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), где B2 — это ячейка, содержащая последовательность protospacer [например, добавив 5′ CACCG последовательности для protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (это Это окончательный вперед oligo, которое заказывается)]. Создайте обратный комплемента (rc) protospacer последовательности.Примечание: например, обратная дополняют вышеупомянутые protospacer-TGGATGAGGGAGAGCACGCG. Добавьте AAAC к 5′ концу rc protospacer. Добавьте дополнительные C 3′ концу rc protospacer (обратный oligo).Примечание: Последовательности «AAAC» гарантирует, что oligo совместим для клонирования в BsmBI усваивается pSB700 вектор. Дополнительные «C» на конце 3′ необходим для отжига последовательности для инициирующей «G», добавил к вперед oligo. Используйте следующую формулу в электронную таблицу для выполнения этой задачи =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), где C2 — это ячейка, содержащий последовательность обратная дополнения [например, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (это заключительный обратный oligo, приказал)]. Закажите олигонуклеотиды, без дополнительных изменений на олигонуклеотиды. Порядок минимальное количество oligo требуется, как только очень небольших количествах необходимы для клонирования реакций. Разбавьте лиофилизированные грунтовки до конечной концентрации 100 мкм в 1 x TE буфера (10 мм трис-Cl, pH 7.5 с 1 мм ЭДТА). Аликвота 1:1 прямого и обратного олигонуклеотиды (например, 10 мкл каждого) в PCR трубки газа Кап.Примечание: Это позволит быстрого клонирования многих оформления одновременно с помощью многоканальных дозаторов. Вортекс и спин вниз oligo смеси (100 x g 15 s). Инкубируйте реакции при комнатной температуре за 5 мин до создания перевязки.Примечание: Нет необходимости для тепла и затем прохладной oligo смеси для облегчения их отжиг. Стоит отметить, что 3-4 пары gRNA олигонуклеотиды могут объединить и отжигом в одном реакции (например, смесь 3 мкл вперед и 3 мкл обратная олигонуклеотиды вместе с до 4 пар oligo gRNA, давая общий объем 24 мкл). Объем олигонуклеотиды, используемые для отжига может корректироваться с учетом потребностей пользователей.Примечание: Шаги 6-7.3 описывают predigestion pSB700. Для альтернативного метода см. шаг 8, который описывает одноступенчатых BsmBI ограничение перевязки. Дайджест 1-5 мкг вектора выражения руководство выбранного pSB700 с BsmBI (0,5 мкл на 1 мкг) за 1 ч при температуре 55 ° C15. Проводить пищеварение вектора выражения gRNA pSB700 в общем объеме 40 мкл (Таблица 1). Запустите пищеварение продуктов на 1,5% (wt/vol) легкоплавких геля агарозы. Вырезать переваривается вектор костяк группы, которая соответствует фрагмент ~ 9 kb в размер и место среза геля в 1,5 мл microcentrifuge трубку (рис. 1). Используйте комплект очистки коммерческих гель для извлечения ДНК из геля агарозы согласно инструкциям производителя. Элюировать ДНК в 10-15 мкл буфера TE (10 мм трис, рН 7,5; 10 мм трис, pH 8.0) для получения концентрированных элюата. Для клонирования gRNA олигонуклеотиды в предварительно усваивается pSB700 выражение вектор перевязать отожженная gRNA олигонуклеотиды из шага 4 в BsmBI усваивается pSB700 руководство выражение вектор в 20 мкл реакции (Таблица 2). Во-первых, добавить воды, буфер и ДНК, а затем вихревой смесь и добавить фермент, вихревые 1 окончательное время после добавления фермента и спин вниз решение (100 x g 15 s). Инкубируйте реакции при комнатной температуре на ночь. Включать без Вставка отрицательный контроль реакции, что одни, без вставки oligo отожженная gRNA переваривается BsmBI вектор. 1 мкл воды может использоваться вместо 1 мкл gRNA олигонуклеотиды для без Вставка отрицательного контроля. Перейти к трансформации (шаг 9).Примечание: Шаг 8 это альтернативный метод для predigestion pSB700, как описано в шагах 6-7.3. Ввести gRNA олигонуклеотиды (описанные в шагах 1-5.1) в pSB700 вектор с помощью Золотые ворота клонирования для единый этапа лигирование BsmBI ограничение. Соберите главный микс (1 x) — Если несколько оформления время клонируются, подготовить мастер смесь без вставки олигонуклеотиды добавил (Таблица 3). Аликвота мастер смешать в PCR трубы и использовать многоканальные пипетки для добавления gRNA олигонуклеотиды из шага 4.2. Включите элемент управления без вставка с помощью 1 мкл воды. Включая BsmBI фермента и T4 ДНК лигаза в такую же реакцию, достигается одновременное ограничение пищеварение и перевязки (т.е., клонирование Золотые ворота). Используйте следующие простые ворота протокол дайджест вектор и перевязать вставок в 1 реакции: Держите реакции при 37 ° C на 2 ч, при 50 ° C за 10 мин, при 65 ° C для 15 мин, при 80 ° C в течение 15 мин и наконец , держите его на 4 ° C. Следует отметить убедитесь, что олигонуклеотиды не содержат BsmBI сайтов перед использованием этого метода. Если оформления, которые копируются в настоящее время содержат места ограничения BsmBI, они будут переварены после добавления BsmBI. Это позволит предотвратить получение любых трансформантов пользователя. После первоначальной реакции простого ворот добавить дополнительные 0,5 мкл BsmBI фермента в каждой реакции и поместите их обратно в 55 ° C за 1 ч. После переваривания удерживайте реакции на 4 ° C, или заморозить его до готовности для преобразования. Этот второй раунд энзима ограничения инкубации удаляет любые непереваренных или religated одичал тип pSB700 векторные позвоночника от реакционной смеси, так что только векторов, которые получили oligo вставки остаются нетронутыми и даст трансформантов. Перейти к трансформации (шаг 9). Трансформировать 0.5 мкл реакционной смеси в 8 мкл сведущее Escherichia coli [например, нос DH5a (1-3 х 109 cfu/мкг ДНК pUC19) или НЭБ стабильной 1 – 3 х 109 cfu/мкг ДНК pUC19). Для лентивирусные плазмид стабильной НЭБ клетки обеспечит более последовательной плазмида урожайности. Удаление кишечной палочки от хранения при температуре-80 ° C и оттепели на льду для 5-10 мин. Добавить 0,5 мкл реакция смеси 8 мкл сведущее Escherichia coli и держать смесь на льду за 30 мин. Тепловой шок смесь при 42 ° C для 45 s. Остальные его на льду на 2 мин. Восстановите культуру на роторный шейкер в 250 мкл SOC СМИ за 1 ч при 37 ° C для NEB DH5a и при 30 ° C для NEB конюшни. Пластины 80 мкл культуры на соответствующие антибиотикорезистентности Lysogeny бульон (LB) плита и проинкубируйте его на ночь при 37 ° C для NEB DH5a и при 30 ° C для NEB конюшни [например, pSB700 является покрытием на фунтов с пластинами ампициллин (100 мкг/мл)] (рис. 3). Проверить последовательность gRNA выражение плазмида: проверить последовательность каждой колонии Сэнгером виртуализации, используя праймер 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ который воспламеняет на U6 промоутер вверх по течению gRNA oligo insert. Выберите 2-3 колоний на реакции для виртуализации (Таблица 4).Примечание: Несколько провайдеров виртуализации теперь предлагают услуги, которые могут выполнять Сэнгер секвенирования непосредственно от бактериальных колоний, которые значительно сокращает время и расходы, устраняя необходимость очищения плазмиды до последовательности. Кроме того плазмиды изоляции комплект может использоваться для восстановления плазмида ДНК от индивидуальных бактериальных клонов. Очищенные плазмид затем могут быть представлены для виртуализации. Если выполняется реакции перешнуровки пула, используйте Таблица 4 в качестве руководства для количество колоний, которые должны быть выбраны и представлен для виртуализации. После подтверждения последовательности изолируйте gRNA выражение плазмид. Используйте кончик стерильные пипетки для инокуляции желаемого колонии в 5 мл культуру LB носитель, содержащий 100 мкг/мл ампициллина для векторов выражения pSB700. Рост клеток в Ротари инкубатора при 100 об/мин при 37 ° C ночь (30 ° C, если используется НЭБ конюшни). Изолируйте плазмида ДНК от культур с использованием подготовка комплекта плазмида, после производителя протокол.Примечание: Хотя выше методы позволяют пользователям создавать единичных векторов gRNA содержащих, этот протокол позволит пользователям создавать векторов, которые содержат 2 оформления, каждый обусловлен их собственных РНК полимеразой III промоутер. Для парных gRNA дизайн использовать выходной файл из инструментов дизайна sgRNA, описанные выше (шаги 1.1-1.4) и выберите 2 направляющие интерес. Для активации или репрессий, выбрать пар гидов, которые по крайней мере 30 nt друг от друга. Для оформления используются для резки выберите руководства, ориентированные на 2 разных экзонов внутри ген. Инструкции ниже назначить первый gRNA в массиве gRNA-A и второй gRNA в массиве gRNA-B, для создания изменения последовательности олигонуклеотида парных gRNA.Примечание: Oligo, используемый для создания gRNA-A будет называться Англии, и обратный oligo используется для введения gRNA-B будет именоваться РБ. Метод клонирования ниже автоматически добавляет инициирующей G к 5′ концу каждого из оформления. Создайте соответствующие фа oligo следующим образом.Примечание: 20 нуклеотидов, включающий gRNA ориентации последовательности для gRNA-A будет представлять последовательность первоначальный ОС, на которой следующие шаги будут строить (например, protospacer – aggggctacaccactcattg). Добавьте TTTTCGTCTCTCACCG к 5′ концу ОС (например, последовательности TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg). Добавьте GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA в 3′ конца ОС (например, последовательности TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Это окончательная версия oligo Англии, которые будут заказаны. Создайте необходимые oligo РБ следующим образом.Примечание: 20 нуклеотидов, включающий gRNA таргетинга последовательности для gRNA-B будет являться исходной последовательности РБ, на котором следующие шаги будут строить (например, о начальной последовательности gtcccctccaccccacagtg). Обратный дополнение РБ = (Ревком) РБ (например, cactgtggggtggaggggac). Добавить TTTTCGTCTCTAAAC к 5′ концу (Ревком) РБ (например., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). Добавить CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG к 3′ концу (Ревком) РБ (например, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Это окончательная версия oligo РБ, которые будут заказаны.Примечание: следующие формулы могут использоваться с общей таблицы программное обеспечение автоматически редактировать oligo последовательности: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), «GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA»), ячейка, содержащая последовательность Англии и , где A2 = Concatenate(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2), «CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG»), где B2 ячейку, содержащую последовательность РБ (Ревком). Заказывайте олигонуклеотиды от поставщика синтез выбора. Дополнительные изменения не требуются. Для выполнения ПЦР с фа и РБ грунтовки используйте подготовленные плазмидной ДНК. Это будет придавать как вперед и обратного оформления для ПЦР фрагментов генерируется эта плазмида и будет позволить каждому выразил от ее собственных промоутер (U6 и 7SK промоутеров — для предотвращения вирусных рекомбинации в этой конструкции используются различные промоутеры). Используйте специальный протокол постановки ПЦР Phusion GC для создания необходимого фрагмента: Держите смеси на 98 ° С в течение 1 мин (1 цикл), в 98 ° C 15 s, в 53 ° C 15 s, 65 ° с 2 мин, а в 72 ° C для 4 мин (30 циклов) , а затем, удерживая его на 4 ° C (Таблица 5). Запустить продукт PCR на геле агарозы 1% и проверить, что 1 группа рассматривается в ~ 490 bp (рис. 2). Вырезать и извлечь этот продукт PCR, используя набор извлечения геля выбора. Элюировать ДНК в 15 мкл буфера TE (10 мм трис, рН 7,5; 10 мм трис, рН 8,0) или дистиллированную воду. Измерьте концентрацию извлечения продукта наряду с pSB700 вектора с спектрофотометр для расчета Молярность ДНК. Нормализовать продукт PCR и вектор к концентрации 40 femtomoles/мкл.Примечание: Некоторые сайты готовы помочь с расчетом Молярность данного решения ДНК, на основе длине ДНК и его концентрация в растворе (например, Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Калькулятор использует формулу:Здесь N — длина последовательности нуклеотидов. Настройка одновременного ограничения пищеварение и перевязка реакции с использованием протокола, изложенные в шаги 8-8.4 для клонирования PCR фрагмент в pSB700 вектор. Вместо добавления 1 мкл раствора грунт на реакцию, добавьте 1 мкл 40 fmole/мкл продукта PCR. Кроме того используйте 1 мкл pSB700 вектора в концентрации 40 fmole/мкл.Примечание: Одинаковый молярный соотношения приводят к последовательным результатам, хотя даже в тех случаях, когда не используются точные коэффициенты, могут быть получены колоний. После завершения процесса реакции Золотые ворота (шаги 8-8.4), переходите к трансформации и последовательности проверки (шаги 9 – 10.2.3).